MYBL2、miR-631在膀胱癌組織中表達(dá)及與患者預(yù)后的關(guān)系

黃宇，李響，胡旭

膀胱癌是產(chǎn)生于膀胱壁上皮組織和間質(zhì)組織的惡性腫瘤，臨床特征主要表現(xiàn)為肉眼可見(jiàn)的間歇性血尿、腎積水、膀胱刺激癥(尿痛、尿頻、尿急)等，嚴(yán)重危害人們生命健康[1-2]。目前臨床上非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者通過(guò)尿道膀胱腫瘤切除手術(shù)治療預(yù)后良好，但肌層浸潤(rùn)性且發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的膀胱癌患者經(jīng)手術(shù)治療后效果不理想，預(yù)后較差，有45%～80%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，再次就診時(shí)已嚴(yán)重?cái)U(kuò)散，患者3年內(nèi)生存率仍沒(méi)有得到很大提高[3-4]。因此，尋找與膀胱癌有關(guān)的靶基因并深入探索其發(fā)病機(jī)制，對(duì)提高患者生存率具有重要意義。成髓細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)錄因子第2亞型(MYB proto-oncogene like 2，MYBL2)是癌基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化等過(guò)程中起重要作用[5]。研究表明，MYBL2參與腎細(xì)胞癌、胃癌、肺癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[6-8]。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類非編碼小分子RNA，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖等過(guò)程中具有極其重要的作用，可調(diào)控多種mRNA的表達(dá)，其在許多癌癥疾病中具有早期診斷和準(zhǔn)確評(píng)估預(yù)后情況的巨大潛力[9-10]。miR-631作為一種miRNA，在卵巢上皮性癌等腫瘤中起重要作用[11]。但是MYBL2、miR-631二者在膀胱癌中的表達(dá)情況及功能尚未可知。因此現(xiàn)研究膀胱癌組織中MYBL2、miR-631表達(dá)水平，并分析它們與患者預(yù)后的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月—2019年5月在四川大學(xué)華西醫(yī)院泌尿外科行手術(shù)治療的膀胱癌患者133例，術(shù)中取患者膀胱癌組織和癌旁正常膀胱組織。其中男81例，女52例，年齡41～80(55.34±12.29)歲；TNM分期[12]：T1～2期81例，T3～4期52例；腫瘤分化程度：中高分化86例，低分化47例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移55例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移78例；病理類型：膀胱尿路上皮癌110例，鱗狀細(xì)胞癌13例，腺癌10例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合膀胱癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]，且經(jīng)病理學(xué)確診；(2)首次患膀胱癌；(3)所有膀胱癌患者在手術(shù)前均未進(jìn)行任何免疫治療、放化療或其他輔助治療；(4)無(wú)腎、肺、心臟等其他重要器官疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)膀胱癌家族遺傳史；(2)長(zhǎng)期服用抑制劑或免疫增強(qiáng)劑藥物者；(3)合并其他惡性腫瘤；(4)存在嚴(yán)重心血管疾病、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病、感染性疾病者；(5)肝腎功能異常者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào)LSJD2016-191)，且患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 MYBL2 mRNA、β-actin、miR-631、U6由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司構(gòu)建；Trizol試劑、兔抗人MYBL2單克隆抗體(上海鈺博生物科技有限公司)；PCR試劑盒、山羊抗兔二抗(南京新惠通生物科技有限公司)；PCR基因擴(kuò)增儀(上海凌儀生物科技有限公司，型號(hào)EP1)；顯微鏡(東莞市譜標(biāo)實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司，型號(hào)SPCC-200)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 MYBL2 mRNA、miR-631表達(dá)水平檢測(cè)：采用熒光定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)，將膀胱癌組織和癌旁正常膀胱組織制成勻漿，提取組織中總RNA，之后反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板，使用PCR試劑盒對(duì)MYBL2 mRNA、miR-631進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95℃ 5 min；91℃ 19 s、55℃ 21 s、60℃ 22 s，循環(huán)31次。MYBL2 mRNA上游引物：5’-CTAGACCGGTTTCTCCTCATTC-3’，下游引物：5’-GCGTGATTGGCGGTCAAAAGAG-3’；內(nèi)參β-actin上游引物：5’-CAGGGCGTGATGGTGGGCA-3’，下游引物：5’-GCTGTCAACCGTTCCAGGTCG-3’。miR-631上游引物：5’-TCTGGCTCCGTGTCTTC-3’，下游引物：5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’；內(nèi)參U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。采用2-△△CT法分析MYBL2 mRNA、miR-631的表達(dá)水平。

1.3.2 MYBL2表達(dá)情況檢測(cè)：采用免疫組化法檢測(cè)，標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋后，制作5 μm的膀胱癌組織和癌旁正常膀胱組織石蠟切片，將其編碼并烘干，進(jìn)行脫蠟、修復(fù)抗原等一系列操作后，加入兔抗人MYBL2單克隆抗體(1∶500)作為一抗，4℃過(guò)夜，使用磷酸緩沖溶液清洗后加入山羊抗兔二抗25℃孵育1 h，使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，蘇木素輕微復(fù)染。使用顯微鏡高倍視野(×200)下觀察切片，PBS代替一抗作為空白對(duì)照。染色強(qiáng)度評(píng)分：0分(無(wú))、1分(弱，淺黃色)、2分(中等，棕黃色)、3分(強(qiáng)，棕褐色)。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：0分(0～5%)、1分(6%～25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)、4分(76%～100%)。將染色強(qiáng)度評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分的乘積作為總計(jì)分[13]：0分為陰性(-)，1～5分為弱陽(yáng)性(+)，6～9分為中度陽(yáng)性(++)，10～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，其中，陰性(-)記為MYBL2陰性，弱陽(yáng)性(+)、中度陽(yáng)性(++)、強(qiáng)陽(yáng)性(+++)記為MYBL2陽(yáng)性。

1.3.3 隨訪情況：通過(guò)電話、醫(yī)院復(fù)查或家訪等方式對(duì)膀胱癌患者進(jìn)行3年隨訪，術(shù)后第1天為隨訪起始日期，術(shù)后第1年每3個(gè)月醫(yī)院復(fù)查1次，第2、3年每6個(gè)月醫(yī)院復(fù)查1次，3年內(nèi)每2個(gè)月通過(guò)電話或家訪，記錄膀胱癌患者生存情況。隨訪截止日期2022年5月31日，以膀胱癌患者3年內(nèi)死亡定義為預(yù)后不良。

2 結(jié) 果

2.1 預(yù)后良好組與預(yù)后不良組臨床資料比較 經(jīng)過(guò)3年隨訪，患者生存89例(預(yù)后良好組)，死亡44例(預(yù)后不良組)，無(wú)失訪病例。預(yù)后不良組T3～4期、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者比例顯著高于預(yù)后良好組(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 預(yù)后良好組與預(yù)后不良組膀胱癌患者臨床資料比較

2.2 膀胱癌組織和癌旁正常膀胱組織MYBL2 mRNA、miR-631表達(dá)水平及MYBL2陽(yáng)性表達(dá)率比較 與癌旁正常膀胱組織比較，膀胱癌組織MYBL2 mRNA表達(dá)水平、MYBL2陽(yáng)性率明顯升高，miR-631表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)表2、圖1。

表2 膀胱癌組織和癌旁正常膀胱組織MYBL2 mRNA、miR-631表達(dá)水平及MYBL2陽(yáng)性率比較

圖1 膀胱癌組織MYBL2表達(dá)情況(免疫組化染色，×200)

2.3 膀胱癌組織MYBL2與miR-631的相關(guān)性分析 生物信息學(xué)ENCORI網(wǎng)站顯示，MYBL2、miR-631存在結(jié)合位點(diǎn)。Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織MYBL2與miR-631表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.424，P<0.001)。

2.4 膀胱癌組織MYBL2、miR-631表達(dá)與患者的預(yù)后關(guān)系 MYBL2陽(yáng)性組、陰性組3年生存率分別為62.50%(70/112)、90.48%(19/21)，MYBL2陽(yáng)性組3年生存率低于MYBL2陰性組(χ2=5.052，P=0.025)；根據(jù)膀胱癌組織miR-631表達(dá)水平均數(shù)(0.71)將患者分為miR-631高表達(dá)組56例(≥0.71)，miR-631低表達(dá)組77例(<0.71)；miR-631低表達(dá)組、高表達(dá)組3年生存率分別為58.44%(45/77)、78.57%(44/56)，miR-631低表達(dá)組3年生存率低于miR-631高表達(dá)組(χ2=5.934，P=0.015)，見(jiàn)圖2。

圖2 膀胱癌組織MYBL2、miR-631表達(dá)與患者3年內(nèi)生存的關(guān)系

2.5 Logistic回歸分析膀胱癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素 多因素Logistic回歸分析表明，TNM分期T3～4期、腫瘤低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及膀胱癌組織MYBL2陽(yáng)性、miR-631低表達(dá)是影響膀胱癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 Logistic回歸分析膀胱癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素

3 討 論

膀胱癌是泌尿外科最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，好發(fā)于50歲以上中老年人，我國(guó)每年約有7萬(wàn)多例新確診的患者，且男性患病率高于女性，膀胱癌在我國(guó)男性泌尿生殖系統(tǒng)疾病中排名第8位，具有較高的發(fā)病率、復(fù)發(fā)率和病死率，近年來(lái)，膀胱癌的患病率、致死率仍逐年上升，且具有趨向年輕化的特點(diǎn)[14-15]。膀胱癌發(fā)病初期病情隱匿，一些患者就診時(shí)已經(jīng)發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是患者預(yù)后較差、3年生存率較低的重要原因[16-17]。因此，尋找與膀胱癌有關(guān)的合適的預(yù)測(cè)因子，可為膀胱癌的臨床診治和預(yù)后評(píng)估提供重要依據(jù)。

MYBL2是轉(zhuǎn)錄因子MYB家族的成員之一，是高度保守的癌基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，可參與調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞生存等多種生理病理過(guò)程[18]。盧洪勝等[19]研究結(jié)果表明，MYBL2在胃腺癌組織中呈高表達(dá)，且MYBL2高表達(dá)患者預(yù)后不良，提示MYBL2可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果表明，膀胱癌組織中MYBL2 mRNA表達(dá)水平和MYBL2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常膀胱組織，提示MYBL2在膀胱癌的發(fā)生中發(fā)揮一定作用；Kaplan-Meier結(jié)果顯示，MYBL2陽(yáng)性組3年生存率低于MYBL2陰性組，提示MYBL2高表達(dá)患者預(yù)后不良；多因素Logistic回歸分析表明，MYBL2陽(yáng)性是影響膀胱癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，提示MYBL2可作為膀胱癌患者預(yù)后評(píng)估的腫瘤標(biāo)志物。

大量研究表明，miRNAs在多種惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程起著不可忽視的作用，近年來(lái)，其在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用引起了研究者們的極大興趣[20-21]，例如，miR-137在膀胱癌組織中呈高表達(dá)，且其水平隨患者病理分級(jí)惡性程度的增加而升高，miR-137在膀胱癌的侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程中具有極其重要的作用[22]。郝朝輝等[23]研究結(jié)果表明，miR-182-5p在膀胱癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，miR-182-5p可能具有促進(jìn)膀胱癌發(fā)生的作用。miR-631作為一種miRNAs，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過(guò)程具有重要作用，余丹揚(yáng)等[11]研究結(jié)果表明，卵巢上皮性癌患者miR-631表達(dá)下調(diào)，且miR-631低表達(dá)患者預(yù)后不良。miR-631在膀胱癌中發(fā)揮的作用研究較少，本研究結(jié)果表明，膀胱癌組織中miR-631表達(dá)水平明顯低于癌旁正常膀胱組織，提示miR-631在膀胱癌的發(fā)生中發(fā)揮一定作用；Kaplan-Meier結(jié)果顯示，miR-631低表達(dá)組3年生存率低于miR-631高表達(dá)組，提示miR-631低表達(dá)患者預(yù)后不良。多因素Logistic回歸分析表明，TNM分期T3～4期、腫瘤低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-631低表達(dá)是影響膀胱癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，提示miR-631可作為膀胱癌患者預(yù)后評(píng)估的腫瘤標(biāo)志物，且臨床上要重點(diǎn)關(guān)注T3～4期、腫瘤低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，及時(shí)給予患者干預(yù)和治療，以減少不良預(yù)后的發(fā)生。生物信息學(xué)ENCORI網(wǎng)站顯示，MYBL2、miR-631存在結(jié)合位點(diǎn)，本研究經(jīng)進(jìn)一步Spearman分析發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中MYBL2與miR-631表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示MYBL2、miR-631可能存在某種靶向關(guān)系，共同參與膀胱癌的發(fā)生進(jìn)展過(guò)程。

綜上所述，miR-631可能通過(guò)負(fù)調(diào)控MYBL2的表達(dá)參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，MYBL2陽(yáng)性、miR-631低表達(dá)均與膀胱癌的發(fā)生及不良預(yù)后有關(guān)，檢測(cè)MYBL2、miR-631水平對(duì)膀胱癌的早期防治及預(yù)后評(píng)估具有重要意義。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

黃宇：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫；李響：病例收集，數(shù)據(jù)整理；胡旭：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，論文修改