基于薄層色譜法和超高效液相色譜法對(duì)龍血竭的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

林爽，王杰，高珊珊，周永康，程立偉，吉艷慧

（1.北京康仁堂藥業(yè)有限公司，北京 101301；2.中藥配方顆粒關(guān)鍵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，天津 301700；3.北京市中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心，北京 101301）

龍血竭（resina dracaenis，RD）是我國(guó)珍稀名貴中藥材，為百合科劍葉龍血樹(shù)含脂木材提取得到的樹(shù)脂，主產(chǎn)于云南、廣西[1]，素有“活血圣藥”之稱(chēng)[2]。龍血竭主要化學(xué)成分有黃酮類(lèi)、酚類(lèi)、萜類(lèi)、甾體及苷類(lèi)、酯類(lèi)和二苯乙烯類(lèi)等[3]；其中黃酮類(lèi)為其主要的活性成分[4-6]，其代表成分有龍血素A、龍血素B及7,4’-二羥基黃酮[7]等；具有二苯乙烯的母核結(jié)構(gòu)的化合物代表有白藜蘆醇及紫檀茋[8]，常作為控制龍血竭藥材質(zhì)量的指標(biāo)性成分。龍血竭在臨床上外用具有止血生肌、止痛等作用，內(nèi)服具有活血祛瘀、定痛等功效[9]。現(xiàn)代藥理表明，龍血竭具有抗腫瘤[10-11]、抗炎[12-13]、保護(hù)心血管[14-15]、活血止血[16-18]、鎮(zhèn)痛[19]等作用。

2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》[20]未收錄龍血竭，僅收錄復(fù)方龍血竭膠囊，并只對(duì)龍血竭的石油醚提取物進(jìn)行薄層鑒別；含量測(cè)定項(xiàng)下對(duì)龍血素A和龍血素B的總含量進(jìn)行了規(guī)定，未收錄指紋圖譜。龍血竭藥材各地方標(biāo)準(zhǔn)基本一致，以《貴州省中藥材民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003年版）[21]為例，薄層鑒別與含量測(cè)定項(xiàng)的供試品制備均操作復(fù)雜，給龍血竭的定性與定量分析造成較大困難。本研究建立薄層色譜（TLC）法，并以超高效液相色譜（UPLC）法建立特征圖譜，同時(shí)通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)深入分析研究影響龍血竭質(zhì)量的主要成分群以評(píng)價(jià)龍血竭質(zhì)量，旨在為龍血竭的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Waters UPLC H-Class Plus超高效液相色譜儀（配備PDA檢測(cè)器）、Empower 3工作站、BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）（美國(guó)沃特世公司）；MSA6.6S.0CE-DM型電子天平（d=0.001 mg）（德國(guó)賽多利斯公司）；ML204T型電子天平（d=0.000 1 g）（瑞士梅特勒托利多公司）；KQ-100DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）；GOODLook-1000型薄層成像系統(tǒng)（上海科哲生化科技有限公司）；硅膠G薄層板（煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所）。

白藜蘆醇（批號(hào)：111535-201703，純度：99.4%）、7，4’-二羥基黃酮（批號(hào)：111787-201002，純度：98.6%）、龍血素B（批號(hào)：111558-201407，純度：99.9%）、龍血素A（批號(hào)：DST202101-119，純度：99.97%）均購(gòu)于成都德斯特科技有限公司；紫檀茋（批號(hào)：P815984，純度≥98.0%）購(gòu)于北京邁瑞達(dá)科技有限公司；龍血竭對(duì)照藥材（批號(hào)：121252-201303）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、磷酸均為色譜純，購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾公司；甲醇為分析純，購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)；水為蒸餾水，購(gòu)于廣州屈臣氏公司。

收集的18批龍血竭藥材為北京康仁堂定點(diǎn)采購(gòu)的百合科植物劍葉龍血樹(shù)Dracaena cochinchinensis (Lour.) S.C.Chen.的樹(shù)脂加工品，經(jīng)北京康仁堂“中藥傳承工作室”工程師于立偉鑒定為正品龍血竭，編號(hào)分別為RD1～RD18，產(chǎn)地均為云南省，樣品具體信息見(jiàn)表1。

表1 龍血竭樣品信息

2 TLC研究

取0.5 g龍血竭藥材粉末，加10 mL乙酸乙酯超聲30 min，過(guò)濾，即得供試品溶液。另取龍血竭對(duì)照藥材0.5 g，同法制得對(duì)照藥材溶液。再分別取龍血素A、龍血素B對(duì)照品適量，加乙酸乙酯配制成每1 mL含1 mg的對(duì)照品溶液。參照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取以上各溶液3～8μL，點(diǎn)于同一塊硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（15∶8∶2∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液的顯色劑，于105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰，可見(jiàn)光下進(jìn)行顯色檢視。結(jié)果顯示，通過(guò)對(duì)18批龍血竭藥材樣品進(jìn)行薄層鑒別，龍血素A、龍血素B斑點(diǎn)清晰，與其他條帶分離良好，供試品色譜在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。（見(jiàn)圖1）

圖1 18 批龍血竭TLC 色譜圖

3 UPLC指紋圖譜及含量測(cè)定研究

3.1 混合對(duì)照品溶液的制備 取白藜蘆醇、7,4’-二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B、紫檀茋對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇配制成每1 mL分別含80、20、60、100、100 μg的混合對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

3.2 供試品溶液的制備 取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.2 g，精密稱(chēng)定，置50 mL錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理10 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.3 色譜條件 采用Waters Acquity UPLCBEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫：0～5 min，15%～25%乙腈；15～35 min，25%～30%乙腈；35～50 min，30%～40%乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；體積流量為0.3 mL/min；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為3 μL。

3.4 指紋圖譜的建立

3.4.1 共有峰確認(rèn)及色譜峰指認(rèn) 按“3.2”項(xiàng)下方法制備RD1～RD18供試品溶液，按“3.3”項(xiàng)下方法記錄色譜圖，進(jìn)行對(duì)照品的比對(duì)，共標(biāo)定16個(gè)共有峰。（見(jiàn)圖2）指認(rèn)出5個(gè)色譜峰[22]，分別為白藜蘆醇、7,4’-二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B、紫檀茋。（見(jiàn)圖3）其中峰14（龍血素B）色譜峰分離較好，基線(xiàn)平穩(wěn)，因此將龍血素B作為參考峰（S）峰。

圖2 18 批龍血竭UPLC 指紋圖譜色譜圖

圖3 龍血竭（RD1）與混合對(duì)照品UPLC 色譜圖

3.4.2 指紋圖譜相似度的評(píng)價(jià) 將獲得的18批龍血竭色譜圖導(dǎo)入到《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)》（2012年版）中，以RD1為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.1，中位數(shù)為對(duì)照?qǐng)D譜的生成方法，以16個(gè)共有峰為Mark峰匹配的方式，得到對(duì)照?qǐng)D譜，計(jì)算RD1～RD18與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度在0.980～0.996之間，說(shuō)明建立的指紋圖譜具有良好的一致性。

3.5 方法學(xué)驗(yàn)證

3.5.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 取白藜蘆醇、7,4’-二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B、紫檀茋對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇配制成每1 mL分別含324.68、65.62、252.48、426.92、25.392 μg的混合對(duì)照品溶液，作為線(xiàn)性1對(duì)照品溶液。精密量取線(xiàn)性1對(duì)照品溶液10.0、5.0、2.0、1.0 mL，分別置20 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得線(xiàn)性2～5對(duì)照品溶液后，按“3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，考察結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 龍血竭中5 種化學(xué)成分線(xiàn)性關(guān)系考察結(jié)果

3.5.2 精密度試驗(yàn) 按“3.2”項(xiàng)下方法制備RD1供試品溶液，按“3.3”項(xiàng)下方法連續(xù)6次，記錄色譜圖，結(jié)果峰1～峰16與S峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值為0.01%～0.56%，相對(duì)峰面積RSD值為0.18%～1.68%，白藜蘆醇、7,4’-二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B、紫檀茋的含量RSD值為0.25%～0.78%。表明儀器的精密度良好。

3.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“3.2”項(xiàng)下方法制備RD1供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h，按“3.3”項(xiàng)下方法記錄色譜圖，結(jié)果峰1～峰16與S峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值為0.01%～0.25%，相對(duì)峰面積RSD值為0.10%～1.21%，白藜蘆醇、7,4’-二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B、紫檀茋的含量RSD值為0.22%～0.98%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

3.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按“3.2”項(xiàng)下方法制備RD1供試品溶液6份，按“3.3”項(xiàng)下方法記錄色譜圖，結(jié)果峰1～峰16與S峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值為0.01%～0.78%，相對(duì)峰面積RSD值為0.15%～1.95%，白藜蘆醇、7,4’-二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B、紫檀茋的含量RSD值為0.33%～1.02%。表明該方法具有良好的重復(fù)性。

3.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 取龍血竭樣品（RD1）粉末6份，每份0.1 g，加入每1 mL分別含40.45、8.20、30.10、52.60、56.25 μg的白藜蘆醇、7,4’-二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B、紫檀茋混合對(duì)照品溶液20 mL，按“3.2”項(xiàng)下方法制備回收率樣品溶液，按“3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分的加樣回收率和RSD值，結(jié)果平均回收率為98.64%～100.89%，RSD值均小于3%，表明該方法測(cè)得的結(jié)果準(zhǔn)確。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

續(xù)表3：

3.6 樣品含量測(cè)定 按“3.2”項(xiàng)下方法制備18批龍血竭樣品溶液，按“3.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算其含量，見(jiàn)表4。

表4 18 批龍血竭中5 種化學(xué)成分含量測(cè)定結(jié)果（n=2）

4 化學(xué)計(jì)量學(xué)研究

4.1 聚類(lèi)分析（cluster analysis，CA）以18批龍血竭的16個(gè)共有峰的峰面積為變量，應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)Z標(biāo)準(zhǔn)化處理，并進(jìn)行CA分析，采用組間聯(lián)接、平方歐式距離的方法，得聚類(lèi)分析結(jié)果。（見(jiàn)圖4）當(dāng)類(lèi)間距離為15時(shí)，樣品被分為三大類(lèi)：RD1～RD10為Ⅰ類(lèi)，樣品來(lái)源于云南省普洱市和臨滄市；RD11～RD12和RD17～RD18為Ⅱ類(lèi)，樣品來(lái)源于云南省西雙版納傣族自治州；RD13～RD16為Ⅲ類(lèi)，樣品來(lái)源于云南省西雙版納傣族自治州。提示龍血竭的質(zhì)量與產(chǎn)地存在一定的關(guān)聯(lián)，同時(shí)又存在其他影響龍血竭質(zhì)量的因素，原因可能為劍葉龍血樹(shù)生長(zhǎng)年限差異或樹(shù)脂加工方法不同。

圖4 聚類(lèi)分析結(jié)果樹(shù)狀圖

4.2 主成分分析（principal component analysis，PCA）以18批龍血竭的16個(gè)共有峰的峰面積為變量，應(yīng)用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Z標(biāo)準(zhǔn)化，并進(jìn)行PCA分析，使用相關(guān)性矩陣的分析方法，得到總方差解釋結(jié)果（見(jiàn)表5）。提取特征值大于1的結(jié)果，共有2個(gè)，累計(jì)旋轉(zhuǎn)載荷平方和為91.596%，認(rèn)為前2個(gè)主成分能夠代表龍血竭絕大部分的質(zhì)量信息。旋轉(zhuǎn)后的成分矩陣（見(jiàn)表6），其中載荷的絕對(duì)值越大，對(duì)主成分的貢獻(xiàn)越大，峰2（7,4’-二羥基黃酮）、峰4、峰7、峰6、峰1（白藜蘆醇）、峰13（龍血素A）、峰14（龍血素B）在主成分1中有較高的載荷值，載荷值的絕對(duì)值均大于0.8；峰10、峰12、峰8、峰16（紫檀菧）在主成分2中有較高的的載荷值，載荷值的絕對(duì)值均大于0.8，說(shuō)明影響龍血竭質(zhì)量的不止一個(gè)因素，可將影響質(zhì)量的主要成分7,4’-二羥基黃酮、白藜蘆醇、龍血素A、龍血素B及紫檀菧作為含量測(cè)定的指標(biāo)性成分。

表5 總方差解釋結(jié)果

續(xù)表5：

表6 主成分矩陣

4.3 綜合評(píng)分計(jì)算 以18批龍血竭的16個(gè)共有峰的峰面積為變量，應(yīng)用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Z標(biāo)準(zhǔn)化，得到Xi。由主成分分析得到成分得分系數(shù)a（見(jiàn)表6），由公式Fi=a1X1+a2X2+……+aiXi計(jì)算F1和F2，綜合得分函數(shù)為F=F1×W1+F2×W2（W為成分載荷百分比）[23]。計(jì)算18批龍血竭樣品的綜合評(píng)分（見(jiàn)表7），其中F值越高，代表以提取到的主成分為指標(biāo)的樣品質(zhì)量越好[24]。根據(jù)F值判斷，聚類(lèi)結(jié)果為Ⅱ類(lèi)的樣品質(zhì)量最好，同時(shí)第Ⅱ類(lèi)樣品5種成分的含量總和亦是最高的，進(jìn)一步驗(yàn)證了含量測(cè)定指標(biāo)的選擇對(duì)樣品質(zhì)量評(píng)價(jià)具有參考價(jià)值。

表7 龍血竭藥材綜合評(píng)分

續(xù)表7：

5 討 論

在TLC考察中，考察以硫酸乙醇溶液和磷鉬酸乙醇溶液作為顯色劑，在使用10%硫酸乙醇溶液時(shí)，色譜圖中龍血素A呈粉紅色斑點(diǎn)，龍血素B呈不清晰的淡黃色斑點(diǎn)；在使用10%磷鉬酸溶液時(shí)，色譜圖中龍血素A、龍血素B分別呈現(xiàn)紫色和深藍(lán)色斑點(diǎn)，兩個(gè)對(duì)照品在色譜圖中較好區(qū)分，同時(shí)供試品色譜圖中其他的斑點(diǎn)顯色清晰，與龍血竭對(duì)照藥材色譜圖中的斑點(diǎn)一致，因此選用以10%磷鉬酸乙醇溶液作為顯色劑。建立的該薄層鑒別方法，相較于貴州省中藥材民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[21]，操作簡(jiǎn)單，色譜圖顯示的信息豐富，能快速達(dá)到對(duì)龍血竭藥材的鑒別。

在UPLC法的研究中，建立了同時(shí)測(cè)定指紋圖譜及含量測(cè)定的方法。指紋圖譜能夠表征龍血竭藥材整體的質(zhì)量，共確定了16個(gè)共有峰，指認(rèn)出5個(gè)色譜峰；鑒于龍血竭中的成分較為復(fù)雜，測(cè)定一兩個(gè)成分往往具有局限性，故本研究同時(shí)對(duì)5種成分進(jìn)行定量分析，較為全面地評(píng)價(jià)龍血竭的質(zhì)量。與現(xiàn)行的貴州省中藥材民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[21]比較，本研究增加了指紋圖譜項(xiàng)，同時(shí)對(duì)除龍血素A和龍血素B為指標(biāo)進(jìn)行定量分析外，還將白藜蘆醇、7,4’-二羥基黃酮、紫檀茋納入定量指標(biāo)，為龍血竭藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定與提升提供較為全面的參考。

從化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)果看，收集的18批龍血竭樣品質(zhì)量存在差異。根據(jù)聚類(lèi)結(jié)果可分為三大類(lèi)，與產(chǎn)地具有一定的相關(guān)性。主成分分析提取出的2個(gè)主成分，能夠代表龍血竭的大部分質(zhì)量信息，同時(shí)根據(jù)各共有峰的載荷值，判斷將白藜蘆醇、7,4’-二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B、紫檀茋定位含量測(cè)定指標(biāo)的合理性。聚類(lèi)結(jié)果與綜合得分F值結(jié)果基本一致。因此，可根據(jù)指紋圖譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合的方式比較龍血竭的質(zhì)量，根據(jù)F值判斷，聚類(lèi)結(jié)果為Ⅱ類(lèi)的樣品質(zhì)量最好；計(jì)算5種成分含量的總和，以第Ⅱ類(lèi)的總含量最高，提示含量測(cè)定或能判斷樣品質(zhì)量的優(yōu)劣。因未收集到足夠多的樣品，未從18批云南產(chǎn)地的龍血竭中得出產(chǎn)地、加工方式的規(guī)律，今后的研究可加以補(bǔ)充其他品質(zhì)的樣品加以研究。