甘遂醋炙減毒機(jī)制的主要途徑及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) Δ

楊曉旭，賀志敏，李文蘭 （哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 150001）

甘遂是大戟科植物甘遂Euphorbia kansui T.N.Liou ex T.P.Wang的干燥塊根，具有良好的瀉水逐飲、消腫散結(jié)的功效[1]，同時(shí)也具有嚴(yán)重的毒副作用，在臨床中多以炮制品入藥，其毒性反應(yīng)表現(xiàn)為肝臟氧化損傷，心臟毒性，腸道毒性，皮膚、口腔黏膜刺激[2]等。研究表明，甘遂經(jīng)醋炙后在保持利尿作用的同時(shí)可降低毒性[3]，然而其減毒機(jī)制不太明確。代謝組學(xué)技術(shù)目前在病理機(jī)制和毒理研究中應(yīng)用越來越廣泛，通過對(duì)生物樣品中相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000的內(nèi)源性代謝物進(jìn)行系統(tǒng)的定性定量分析，探索代謝物與機(jī)體生理、病理變化的相關(guān)性，以評(píng)價(jià)生物體復(fù)雜體系相互作用，及內(nèi)外因素刺激下的整體動(dòng)態(tài)代謝反應(yīng)[4]。本實(shí)驗(yàn)通過超高效液相色譜串聯(lián)四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-Q-Exactive-MS）代謝組學(xué)技術(shù)，研究甘遂醋炙前后對(duì)生理狀態(tài)大鼠尿液中內(nèi)源性代謝物的影響，通過分析代謝物的不同表達(dá)及其生物學(xué)意義，找出醋炙后甘遂減毒的作用靶點(diǎn)及通路，為探討其炮制減毒機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有AS3120A型超聲波清洗器（無錫江星清洗設(shè)備有限公司），F(xiàn)A2204B型電子天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司），Q-Exactive型四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀、Ultimate 3000型超高效液相色譜系統(tǒng)[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]等。

1.2 主要藥品與試劑

甘遂藥材（產(chǎn)地河南，批號(hào)101179）購(gòu)自河南江正中藥材有限公司，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源學(xué)教研室王振月教授鑒定為大戟科植物甘遂E. kansui T.N.Liou ex T.P.Wang的干燥塊根；乙酸銨（批號(hào)BZ300102）、乙腈（批號(hào)011-0052）、甲醇（批號(hào)007-1623）均購(gòu)自德國(guó)默克公司；水為蒸餾水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24只雄性SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量為（200±20）g，購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（吉）2018-0007，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理審查編號(hào)為HSDYXY-2021003。大鼠飼養(yǎng)在溫度為22 ℃，相對(duì)濕度為40%左右，8：00到20：00燈光照明的環(huán)境中，標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水，在代謝籠中適應(yīng)1周之后開始實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 供試品藥液制備

取甘遂藥材，按2020年版《中國(guó)藥典》（四部）醋炙法（通則0213）[5]進(jìn)行炮制。將甘遂生品和炮制品分別打粉過4號(hào)篩，以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液配制成質(zhì)量濃度為85 mg/mL的藥液[2，6]，作為供試品藥液。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、給藥及尿液樣品采集

取24只大鼠，隨機(jī)分為3組，每組8只，分別為空白組、生甘遂組、醋甘遂組。空白組大鼠灌胃0.5%CMC-Na溶液，生甘遂組、醋甘遂組大鼠給予相應(yīng)的供試品藥液（850 mg/kg，2020年版《中國(guó)藥典》中記載甘遂臨床生藥最大用量的10倍劑量），給藥體積均為10 mL/kg，連續(xù)給藥20 d[7]。第20天收集大鼠12 h尿液，收集后立即離心（12 000 r/min，4 ℃）10 min，分離上清液于－80 ℃凍存，進(jìn)行分析前室溫解凍。

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液 用移液槍準(zhǔn)確吸取200 μL尿液，加入800 μL預(yù)冷的甲醇-乙腈-水溶液（4∶4∶2，V/V/V），渦旋混合，－20 ℃靜置60 min，于4 ℃下14 000 r/min離心20 min，取上清液真空干燥；質(zhì)譜分析時(shí)加入100 μL乙腈-水溶液（1∶1，V/V）復(fù)溶，渦旋，于4 ℃下14 000 r/min離心15 min，取上清液，即得。

2.3.2 質(zhì)控樣本溶液 取空白組、生甘遂組、醋甘遂組樣品等量混合后，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備成質(zhì)控樣本溶液。

2.4 UPLC-Q-Exactive-MS分析條件

2.4.1 色譜條件 采用ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）為色譜柱，以0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～1 min，5%B；1～9 min，5%B→100%B；9～12 min，100%B；12～15 min，100%B→5%B）；柱溫為40 °C；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣體積為5 μL；樣品盤溫度為4 ℃。

2.4.2 質(zhì)譜條件 分別采用電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）下正、負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)。ESI條件如下：噴霧氣為60 arb，輔助加熱氣為60 arb，氣簾氣為30 arb，離子源溫度為320 ℃，噴霧電壓為±3 500 V（正、負(fù)兩種模式）；質(zhì)量掃描范圍為80～1 200 Da；子離子分辨率為17 500；一級(jí)質(zhì)譜掃描頻率為0.20 spectra/s，子離子掃描頻率為0.05 spectra/s；二級(jí)質(zhì)譜采用信息依賴性獲取（information-dependent acquisition，IDA）獲得，并且采用high sensitivity模式，錐孔電壓為±60 V（正、負(fù)兩種模式），碰撞能量為（35±15）eV，IDA設(shè)置為排除4 Da以內(nèi)的同位素，每個(gè)周期監(jiān)測(cè)6個(gè)候選離子。

2.5 樣品分析

質(zhì)控樣本用于測(cè)定儀器狀態(tài)及平衡色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)，評(píng)價(jià)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中系統(tǒng)穩(wěn)定性。為避免儀器檢測(cè)信號(hào)波動(dòng)而造成的影響，采用隨機(jī)順序進(jìn)行樣本的連續(xù)分析，在樣本隊(duì)列每組樣品后插入質(zhì)控樣本，從而監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)系統(tǒng)的穩(wěn)定性及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。按照“2.4”項(xiàng)下分析條件進(jìn)行正、負(fù)離子交替模式全掃描。

2.6 數(shù)據(jù)處理

將質(zhì)譜采集得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過Compound Discoverer 3.0軟件進(jìn)行峰提取、峰對(duì)齊、峰校正、標(biāo)準(zhǔn)化等數(shù)據(jù)前處理。輸出由樣本名稱、譜峰信息（包括保留時(shí)間和分子量）及峰面積組成的三維數(shù)據(jù)矩陣。代謝物結(jié)構(gòu)鑒定采用精確質(zhì)量數(shù)匹配小于25 ppm和二級(jí)譜圖匹配的方式，檢索實(shí)驗(yàn)室自建數(shù)據(jù)庫(kù)以及BioCyc、HMDB、METLIN、HFMDB、LIPID MAPS等數(shù)據(jù)庫(kù)。應(yīng)用SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行模式識(shí)別（Umetrics、Umea、Sweden 3種模式），數(shù)據(jù)經(jīng)Pareto-scaling預(yù)處理后，進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析，包括無監(jiān)督的主成分分析（principle components analysis，PCA）和有監(jiān)督的正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），從而在同一判別標(biāo)準(zhǔn)下觀察不同組別是否呈現(xiàn)各自聚類現(xiàn)象。通過MetaboAnalyst（https：//www.metaboanalyst.ca/）對(duì)所得差異代謝物進(jìn)行顯著富集通路分析，對(duì)甘遂炮制減毒機(jī)制潛在靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)結(jié)果

將3組供試品溶液檢測(cè)后的質(zhì)控樣本總離子流圖（圖1）進(jìn)行比較，結(jié)果表明，各色譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度和保留時(shí)間基本重疊，說明在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中儀器誤差引起的變異較小，檢測(cè)環(huán)境相對(duì)較穩(wěn)定。

圖1 3組供試品溶液檢測(cè)后質(zhì)控樣本的總離子流圖

3.2 甘遂醋炙前后對(duì)生理狀態(tài)大鼠尿液代謝輪廓表征的影響

如圖2所示，生甘遂組、醋甘遂組和空白組大鼠尿液代謝輪廓有一定差異。

圖2 3組大鼠尿液的總離子流圖

3.3 總體樣本的PCA

各組大鼠尿液代謝物離子峰進(jìn)行數(shù)據(jù)降維和質(zhì)譜矩陣信息提取后得到6 364個(gè)正離子峰和6 278個(gè)負(fù)離子峰。將所有實(shí)驗(yàn)樣本和質(zhì)控樣本提取得到的峰，經(jīng)Pareto-scaling后進(jìn)行無監(jiān)督的PCA，觀察聚類分組情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生甘遂組、醋甘遂組分別與空白組區(qū)分明顯，結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 生甘遂組與空白組對(duì)比的正、負(fù)離子模式PCA得分圖

圖4 醋甘遂組與空白組對(duì)比的正、負(fù)離子模式PCA得分圖

3.4 總體樣本的OPLS-DA

運(yùn)用OPLS-DA建立代謝物表達(dá)量與樣品類別之間的關(guān)系模型，來實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品類別的預(yù)測(cè)。同時(shí)通過計(jì)算變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值來衡量各代謝物的表達(dá)模式對(duì)各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，從而輔助標(biāo)志代謝物的篩選（以VIP值＞1作為篩選標(biāo)準(zhǔn)）。如圖5、圖6所示，可見OPLS-DA能區(qū)分生甘遂組、醋甘遂組與空白組樣本，正、負(fù)離子模式數(shù)據(jù)建立的OPLS-DA未發(fā)生過度擬合。

圖5 生甘遂與空白組對(duì)比的正、負(fù)離子模式OPLS-DA得分圖

圖6 醋甘遂組與空白組對(duì)比的正、負(fù)離子模式OPLSDA得分圖

3.5 生甘遂與空白組尿液中顯著性差異代謝物的篩選

以P＜0.05，VIP值＞1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出組間差異物1 042個(gè)，其中與空白組相比，生甘遂組表達(dá)量上調(diào)的差異物553個(gè)，下調(diào)的差異物489個(gè)。經(jīng)HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)一步篩選出與人類代謝密切相關(guān)的內(nèi)源性代謝物20個(gè)，以此作為顯著性差異代謝物，其中上調(diào)的代謝物12個(gè)，下調(diào)的代謝物8個(gè)。結(jié)果見表1。

表1 生甘遂組與空白組尿液中顯著性差異代謝物信息

3.6 醋甘遂對(duì)生理狀態(tài)大鼠尿液中目標(biāo)生物標(biāo)志物的調(diào)節(jié)作用

以生甘遂組與空白組比對(duì)的具有生物學(xué)意義的顯著性差異代謝物作為基準(zhǔn)，與醋甘遂組中具有顯著性差異的代謝物進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有10個(gè)代謝物出現(xiàn)顯著變化，以此為目標(biāo)生物標(biāo)志物，其中上調(diào)標(biāo)志物3個(gè)，下調(diào)標(biāo)志物7個(gè)。結(jié)果見表2。

表2 醋甘遂對(duì)生理狀態(tài)大鼠尿液中目標(biāo)生物標(biāo)志物的調(diào)節(jié)作用

3.7 目標(biāo)生物標(biāo)志物的MetaboAnalyst代謝通路分析

將表2中10個(gè)目標(biāo)生物標(biāo)志物作為醋甘遂對(duì)正常生理狀態(tài)大鼠尿液代謝發(fā)揮主要調(diào)節(jié)作用的靶點(diǎn)，進(jìn)行MetaboAnalyst顯著富集通路分析（圖7），如圖顯示參與的主要代謝通路分別為精氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，精氨酸和D-鳥氨酸代謝。結(jié)果見表3。

圖7 目標(biāo)生物標(biāo)志物的代謝通路富集圖

表3 目標(biāo)生物標(biāo)志物的主要代謝通路分析

4 討論

N-乙酰基-L-天冬氨酸是天冬氨酸的衍生物，可充當(dāng)神經(jīng)滲透壓劑參與大腦液體平衡，在氨基產(chǎn)生能量方面發(fā)揮潛在作用。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期高水平的N-乙酰基-L-天冬氨酸與腦白質(zhì)海綿狀變性綜合征有關(guān)，并發(fā)有機(jī)酸血癥[8]。由本研究結(jié)果可知，N-乙酰基-L-天冬氨酸在生甘遂組中代謝水平是空白組的1.65倍，經(jīng)過醋炙后趨勢(shì)顯著回調(diào)。

L-高精氨酸可增加一氧化氮的利用率，從而增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)皮功能，發(fā)揮與心血管健康相關(guān)的積極作用，是一種具有多種生物學(xué)功能的強(qiáng)效血管擴(kuò)張劑[9]。臨床數(shù)據(jù)表明，L-高精氨酸能減少缺血和再灌注損傷造成的損害[10]，血清中L-高精氨酸濃度是心血管疾病死亡率的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)[11]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)L-高精氨酸與肝硬化和遺傳疾病高精氨酸血癥有關(guān)，在1型糖尿病患者血清中L-高精氨酸水平較低[12]。由本研究結(jié)果可知，L-高精氨酸在生甘遂組大鼠尿液中代謝水平較空白組降低了1.27倍，經(jīng)醋炙后其代謝水平顯著升高，表明甘遂經(jīng)醋炙后可能降低誘發(fā)心腦血管疾病的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

精氨酸琥珀酸可在檸檬酸循環(huán)中通過精氨酸琥珀酸酯（argininosuccinate，ASA）裂解酶代謝，ASA裂解酶缺乏表現(xiàn)為高氨血癥的傾向，影響ASA通過腎臟排泄速率，且在肝細(xì)胞中蓄積而引起一定程度的毒性[13]。由本研究結(jié)果可知，精氨酸琥珀酸在生甘遂組大鼠尿液中代謝水平較空白組降低了3.11倍，經(jīng)醋炙后其代謝水平趨勢(shì)顯著回調(diào)。

L-蛋氨酸是半胱氨酸的代謝前體。急性劑量的蛋氨酸可導(dǎo)致血漿中同型半胱氨酸急劇增加，可作為心血管疾病易感性的指標(biāo)。對(duì)成年人的長(zhǎng)期研究表明，當(dāng)?shù)鞍彼岷孔銐蚋邥r(shí)，可引起動(dòng)脈粥樣硬化和球蛋白水解作用，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和心血管疾病[14]。由本研究結(jié)果可知，L-蛋氨酸在生甘遂組大鼠尿液中代謝水平較空白組降低了1.39倍，經(jīng)醋炙后其代謝水平趨勢(shì)進(jìn)一步降低。

3-磷酸羥基丙酮酸也被稱為磷酸羥基丙酮酸，參與多種酶促反應(yīng)。由本研究結(jié)果可知，3-磷酸羥基丙酮酸在生甘遂組大鼠尿液中代謝水平較空白組降低了1.32倍，經(jīng)醋炙后其代謝水平趨勢(shì)進(jìn)一步降低。

實(shí)驗(yàn)分析還發(fā)現(xiàn)，甘遂經(jīng)醋炙后其主要作用途徑還與3-羥基十四烷二酸、十二烷二酸、N-十一烷酰甘氨酸、10-硝基亞油酸（10-nitrolinoleic acid，LNO2）代謝趨勢(shì)改變有關(guān)。

其中，3-羥基十四烷二酸是一種不常見的3-羥基二羧酸的人代謝產(chǎn)物，在3-羥基二羧酸尿癥患者的尿液中檢測(cè)到高水平的3-羥基十四烷二酸，這是由于泛酸缺乏導(dǎo)致與酒石酸相關(guān)的急性中毒，或在應(yīng)激感染期間，脂肪酸不完全氧化減弱CoA反應(yīng)而導(dǎo)致的[15]。由本研究結(jié)果可知，3-羥基十四烷二酸在生甘遂組大鼠尿液中代謝水平較空白組升高了2.02倍，經(jīng)醋炙后其代謝水平趨勢(shì)顯著降低。

十二烷二酸是脂質(zhì)和碳水化合物代謝途徑中出現(xiàn)的物質(zhì)。尿液中十二烷二酸水平的升高是肝肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ缺乏的標(biāo)志，尿液中十二烷二酸水平升高表現(xiàn)為低酮癥性二羧酸尿癥，這是由于十二烷二羧酸主要在肝臟中經(jīng)過氧化物酶體氧化，對(duì)線粒體脂肪酸氧化形成負(fù)調(diào)控，導(dǎo)致脂肪酸分解代謝下調(diào)而造成的肝臟脂肪積累，出現(xiàn)明顯的脂肪變性[16]。由本研究結(jié)果可知，十二烷二酸在生甘遂組大鼠尿液中代謝水平較空白組升高了1.71倍，經(jīng)醋炙后其代謝水平顯著降低。

N-十一烷酰甘氨酸在各種脂肪酸氧化異常患者的尿液和血液中含量升高[17]。由本研究結(jié)果可知，N-十一烷酰甘氨酸在生甘遂組大鼠尿液中代謝水平較空白組升高了1.53倍，經(jīng)醋炙后其代謝水平顯著降低。

2-氧精氨酸在精氨酸血癥患者中水平升高。2-氧精氨酸的積累可能在精氨酸血癥中引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害[17]。此外，高水平的2-氧精氨酸可能與丙烯酰胺神經(jīng)毒性有關(guān)，2-氧精氨酸可作為丙烯酰胺存在的敏感生物標(biāo)志物，為毒性機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)[18]。由本研究結(jié)果可知，2-氧精氨酸在生甘遂組大鼠尿液中代謝水平較空白組升高了1.91倍，經(jīng)醋炙后其代謝水平顯著降低。

在發(fā)生氧化炎癥反應(yīng)時(shí)，LNO2能誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1的表達(dá)，表現(xiàn)出多重抗炎細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)特性[19]。LNO2可預(yù)防腫瘤壞死因子α刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化反應(yīng)，可抑制腫瘤壞死因子α刺激白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素8、白介素12 p40、γ干擾素、單核細(xì)胞趨化蛋白-1和干擾素誘導(dǎo)蛋白-10細(xì)胞因子的釋放[20]。由本研究結(jié)果可知，LNO2在生甘遂組大鼠尿液中代謝水平較空白組降低了3.12倍，經(jīng)醋炙后其代謝水平顯著升高。

綜上所述，甘遂經(jīng)過醋炙后，可發(fā)揮多靶點(diǎn)、多趨勢(shì)、多途徑的減毒作用，其作用機(jī)制主要通過降低N-乙酰基-L-天冬氨酸水平緩解神經(jīng)毒性，通過升高L-高精氨酸水平對(duì)心腦血管系統(tǒng)發(fā)揮保護(hù)作用，通過升高LNO2、降低N-十一烷酰甘氨酸的水平，對(duì)炎性反應(yīng)的激活有抑制作用等。生甘遂對(duì)正常生理狀態(tài)大鼠尿液代謝中生物標(biāo)志物存在明顯的干預(yù)作用，經(jīng)醋炙后其對(duì)機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及能量代謝等方面的不利因素有明顯改善，其發(fā)揮減毒機(jī)制的最集中相關(guān)代謝通路為精氨酸生物合成。