墨西哥落羽杉扦插繁殖與生根機制研究

吳利雪 常麗娜 馮 緣 郭金慶 孫 明

（北京林業大學園林學院/花卉種質創新與分子育種北京市重點試驗室/國家花卉工程技術研究中心 北京 100083）

墨西哥落羽杉（Taxodium mucronatum）為杉科落羽杉屬樹種，主要分布于我國長江以南各省份。近年來人們對于濱水綠化樹種越來越重視，墨西哥落羽杉作為南方典型的彩葉濱水樹種，在園林景觀中具有廣泛的生態價值和應用前景。而且因其生長速度快、觀賞價值高、耐低溫、耐水濕、耐鹽堿及抗病蟲害等優點，兼具生態價值和工業利用價值[1]。因此，推廣并規模化繁殖墨西哥落羽杉，不僅可以滿足建設低碳園林的要求，而且可以彌補北方地區濱水景觀色彩單一的不足，應用前景十分廣泛。

目前墨西哥落羽杉的繁殖主要利用傳統的播種繁殖和嫁接育苗等繁殖方法，但這2種繁殖方法存在效率低，且因難以保持親本優良性狀等問題，嚴重影響了落羽杉的工廠化繁殖。扦插繁殖技術繁殖效率高，扦插材料充足，能夠滿足大批量的生產。相關學者對墨西哥落羽杉扦插繁殖技術進行了試驗研究，但是對其生根機制的研究較少[2-3]。因此立足于生產實際的需要，本研究深入探討植物生長調節劑等因素對墨西哥落羽杉扦插生根的影響，并對扦插過程中墨西哥落羽杉內源激素及氧化酶活性的變化進行觀察與檢測，明確其與愈傷組織誘導、不定根形成之間的響應機制及相關性，進一步篩選出能夠促進墨西哥落羽杉插穗生根的激素處理組合，為其高效率繁殖的關鍵技術提供理論依據，也為北方地區墨西哥落羽杉規模化生產提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于濟南市長清區農業園基地的溫室（36°38′12″N，116°46′50″E），氣候類型為溫帶季風氣候。試驗于基地溫室內搭建的小拱棚內進行，棚內扦插池為長方形，插床長約8 m、寬約2.5 m、高0.5 m。棚膜上方架設遮光率為80%的遮陽網，鋪設地熱線并設置自動噴霧設備，給排水正常。空氣濕度控制在90%～95%，氣溫控制在30～35°C。

1.2 試驗設計

在2020年6月中旬采集當年生枝條為插穗，長度8~12 cm。將制作好的插穗扦插在草炭∶珍珠巖為3∶7的基質中[2]。本試驗采用3因素3水平L9（34）進行正交試驗設計，共設置9個處理組和1個清水對照，每個處理重復3次，每個重復處理120根插穗（表1）。本試驗用清水作為對照。扦插后每隔5 d隨機拔出5根試驗苗，拍照觀察愈傷組織生長及生根情況，取有代表性的切片在顯微鏡下觀察、拍照并記錄，并測量與比較各處理中插穗內源激素與酶活性的變化。

表1 植物生長調節劑處理正交試驗設計

1.3 插后管理

扦插當天充分澆灌插床，為減少水分散失，前期密閉棚膜保濕。之后每周噴施1次50%多菌靈可濕性粉劑800倍液對插床及插穗殺菌消毒，及時清理腐爛、死亡的插穗。安裝溫濕度計，實時監測棚內溫濕度。

1.4 測定方法

1.4.1 形態觀察扦插后每隔5 d將破壞性試驗苗隨機拔出5根，觀察愈傷組織生長及生根情況。

1.4.2 生根指標測定在各扦插試驗后每周觀察記錄生根進程，并在扦插60 d后統計以下生根指標[4]。

1.4.3 生理指標測定以正交試驗篩選出的最優組合作為試驗組，設立清水對照，采用完全隨機區組試驗，各處理均保持在條件相對一致的環境中。自扦插日起60 d內每隔10 d進行取樣，每次取樣5根，取樣時間為上午8:00-9:30。每次取樣后立即清洗插穗，截取基部2 cm處的韌皮部，用液氮速凍后于超低溫冰箱（-80℃）中保存備用。

對保留的整株樣本采用酶聯免疫法（ELISA）測定內源激素IAA、ABA和ZR的含量，分別采用愈創木酚法和氮藍四唑光還原法來測定過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性[5-6]。

1.5 數據處理

采用Microsoft Excel 2016進行數據統計與表格制作，使用SPSS21.0軟件進行方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 墨西哥落羽杉插穗生根形態學觀察

2.1.1 插穗生根類型分析由圖1可知，墨西哥落羽杉插穗有2種生根類型，即愈傷組織生根型和皮部生根型。不同處理對生根類型的影響差異顯著，經GGR處理的插穗，生根情況明顯優于對照組處理，并且這些生根插穗中，愈傷組織生根型占74.13%，皮部生根型僅占12.35%。由此可知，墨西哥落羽杉以愈傷組織生根型為主，生根難度較大，這與同屬樹種中山杉的研究結果一致[7]。

圖1 墨西哥落羽杉扦插生根類型

2.1.2 扦插生根過程分析通過跟蹤觀察墨西哥落羽杉插穗扦插過程中的形態變化，將扦插生根過程分為4個階段：①愈傷組織形成期。在扦插后10~20 d插穗基部的切口處開始膨大，皮部出現白色半透明狀的膨大部分；扦插后20~30 d，在基部5 mm的范圍內出現了白色點狀凸起。②根原基誘導期。扦插后30~40 d愈傷組織的數量繼續增加，連接成環，并有部分插穗的愈傷組織開始形成不定根。③不定根形成期。扦插后40~50 d，大部分插穗開始形成不定根。④不定根伸長期。扦插后50~60 d，不定根的根系增長增粗，并且有一部分插穗生成側根。

2.2 不同處理下墨西哥落羽杉扦插生根的情況

由表2可知，不同處理對插穗的各項生根指標均達到極顯著水平（P<0.01）。進一步對不同處理間生長性狀進行比較，結果表明，處理后的插穗全部生根，其中處理3的生根率最高，達92.80%，產生的不定根數最多，為6.33條/株，根系效果指數最大，為0.87。處理5的插穗生根效果最差，生根率僅為42.38%。同時，生長調節劑也影響根的長度，以處理8的平均根長最長，為4.17 cm（表3）。

表2 不同處理組合對墨西哥落羽杉插穗生根影響的方差分析

表3 不同處理組合對墨西哥落羽杉插穗生根的影響

圖3 各因素對墨西哥落羽杉扦插平均根長的極差分析

比較3個因素對各項生根指標的極差可知（圖2~圖5），3個因素的主次關系為激素種類（A）>激素濃度（B）>浸泡時間（C）。從各因素水平對生根率的影響方面分析，扦插處理最優組合為A1B3C3；從對平均根長的影響方面分析，扦插處理最優組合為A1B2C1；從對平均根數的影響方面分析，扦插處理最優組合為A3B3C3；從對根系效果的影響方面分析，扦插處理最優組合為A1B3C3。綜合比較，可以確定墨西哥落羽杉嫩枝扦插優化體系為A1B3C3，即取半木質化插穗為試驗材料，用2 000 mg/L的GGR處理插穗30 s為最優生根組合。

圖2 各因素對墨西哥落羽杉扦插生根率的極差分析

圖4 各因素對墨西哥落羽杉扦插平均根數的極差分析

圖5 各因素對墨西哥落羽杉扦插根系效果的極差分析

2.3 生根過程中內源激素含量變化

在生根過程中，內源激素的變化趨勢與不定根的誘導和形成等關鍵時期有著同頻共振的關系。因此，將上述試驗所得到最優的植物生長激素處理組合（GGR）和對照（CK）處理下的插穗在不同時期植物的內源激素的差異以及變化規律進行了比較。由圖6可知，處理組和對照組插穗IAA的含量都是先升高后下降。其中處理組和對照組在愈傷組織形成階段（扦插后30 d）和根原基誘導階段（扦插后40 d）一直處于上升狀態，且處理組在根原基誘導階段（扦插后40 d）結束時含量最高，隨后IAA含量明顯下降。而對照組變化則相對滯后，在不定根形成期（扦插后50 d）才達到最大值，于不定根伸長階段（扦插后60 d）不斷下降。而且在不同時期，處理組IAA含量均明顯高于對照組的含量。不同處理下ABA含量呈現先下降再升高最后下降的趨勢，而且不同時期對照組插穗ABA含量均大于處理組，在愈傷組織形成階段兩者差異達到最大（圖7）。在根原基形成及不定根形成階段，ABA含量不斷下降。與前2種激素變化趨勢不同的是，處理組和對照組中的ZR含量為先下降后上升的趨勢（圖8）。處理組在愈傷組織形成時期（扦插后30 d）含量達到最低，之后ZR含量開始回升。在不定根形成及伸長階段，處理組中ZR的含量明顯低于對照組，在不定根形成階段差異最為顯著。

圖6 GGR對墨西哥落羽杉扦插生根過程內源激素IAA的影響

圖7 GGR對墨西哥落羽杉扦插生根過程內源激素ABA的影響

圖8 GGR對墨西哥落羽杉扦插生根過程內源激素ZR的影響

2.4 生根過程中氧化酶含量變化

2.4.1 SOD活性的變化由圖9可知，對照組與處理組插穗內SOD的活性變化曲線大致相同，均是先上升后下降。在愈傷組織形成期（扦插后30 d）和根原基誘導期（扦插后40 d），SOD活性逐漸上升，并在不定根形成期（扦插后50 d）達到最高水平。待不定根形成后，SOD活性有所下降。總的來看，處理組插穗SOD活性均明顯高于對照組。

圖9 GGR對墨西哥落羽杉扦插生根過程中SOD活性的影響

2.4.2 POD活性的變化不同處理下插穗生根過程中的POD活性整體呈先升高后降低的變化趨勢（圖10）。在愈傷組織形成階段（扦插后30 d），經過GGR處理的插穗的POD活性雖然處于下降趨勢，但是含量明顯高于CK處理。隨后在根原基形成期（扦插后40 d）活性不斷上升并達到峰值，但在不定根形成及伸長階段開始下降。而處理組的插穗，POD活性在不定根形成前不斷上升，在不定根形成期達到最高水平，之后逐漸降低。整體來看，在根原基形成前處理組插穗POD的活性要明顯優于對照組。但在不定根形成期，POD活性下降的速度較對照組插穗更快。

圖10 GGR對墨西哥落羽杉扦插生根過程中POD活性的影響

3 討論與結論

3.1 植物生長調節劑對墨西哥落羽杉扦插生根的影響

不定根的形成是植物營養繁殖的重要步驟。這是一個復雜的過程，受多種內源性如生長調節劑的內穩態、酚類化合物的水平、酶活性及外源性因素的影響，包括營養狀況、相關應激反應、生物相互作用和遺傳特征等[8]。植物生長調節劑在促進植物插穗生根方面有著重要作用，不僅可以調動內源激素的變化，還可加快植物營養物質代謝的速度并加大其強度，從而能夠促進插穗不定根的分化與形成[9-11]。多項研究表明[13-15]，相比于NAA、IAA等單一植物激素，ABT作為一種混合的植物生長調節劑能夠多樣地補充植物生根過程中所需要的激素，這與本試驗研究結果相似。與ABT生根粉不同的是，GGR屬于非激素型的生理活性物質，植物經GGR處理后更易生根，生根生長進程更快[16]。這可能是因為GGR中的NAA和IAA的含量比例調配更加有利于植株的生長發育[17-18]。除植物生長調節劑種類外，其濃度和浸泡的時間都會對植物扦插生根產生極大的影響。陳寒蕾等的研究發現，不同濃度生長素均可促進菜桑和果桑的生長；郭其強等的研究發現，2種西藏柏樹插穗的生根對不同濃度的生長素和浸泡時間的影響明顯，這與本試驗研究結果相同。

3.2 植物內源激素變化對墨西哥落羽杉扦插生根的影響

植物內源激素調控著植物的發育過程，影響著植物的生長變化。莖生根受內源激素代謝的密切調節，其中內源激素包括IAA、ZR和ABA。IAA和ZR促進根形成，而ABA抑制根形成[9-10]。在本研究中，處理組的IAA含量在整個過程中都高于對照組，證實了外源激素具有增加內源性激素調節能力的作用。GGR處理后的插穗在不定根形成與伸長階段ZR的含量都明顯低于對照組，這與ZR促進根的形成相矛盾。這可能是因為墨西哥落羽杉對GGR比較敏感，對GGR表現為高抑低促的現象[19]。此外Kuroha等也有類似的發現，ZR對黃瓜（Cucumis sativus）下胚軸的不定根的形成具有負調節作用。當黃瓜的根被切斷時，ZR水平會迅速下降，同時生長素積累會發生在被切斷的下胚軸或莖的基部，導致ARS的形成[20]。此研究結果可以解釋本研究中不同生長階段ZR含量的變化趨勢。GGR處理后的插穗在整個生根過程中，處理組ABA含量幾乎都低于對照組，可見低水平的ABA有利于插穗不定根的形成，這與前人的研究結果相似，認為ABA不僅抑制IAA的合成和極性運輸，而且阻止IAA從結合態釋放到游離態，從而抑制不定根的形成[21-22]。因此，GGR通過抑制ABA合成來增加IAA水平顯然是促進根系形成的有效途徑。除ABA的峰值早于不定根的萌發外，IAA和ZR達到峰值的時間與不定根的萌發時間（扦插后40 d）同步，這可以解釋為ZR在不定根萌發的早期發揮作用。由這些結果可得出，外源性激素GGR通過動態調節各內源激素的含量，加速了墨西哥落羽杉內源性激素的調節過程，從而增強了墨西哥落羽杉的生根能力[23-24]。

3.3 氧化酶活性變化對墨西哥落羽杉扦插生根的影響

植物生長調節劑能夠促進插穗內酶的活性，提高植物的分化與再生的能力。其中，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）是與植物扦插生根關系密切的2種氧化酶類。SOD的活性是植物插穗對抗外界傷害能力的指標之一，對于植物根系的形成和發育不但有促進作用，而且能夠縮短整個生根過程的時間[25-26]。本研究中GGR處理組SOD的活性始終高于對照組，說明墨西哥落羽杉在生根過程需要高濃度的SOD，這可能也是其難生根的主要因素之一。本研究中，處理組POD活性在愈傷組織形成階段始終高于對照組，是因為高POD活性有利于降解不利于愈傷形成的IAA[27-28]。相反，在不定根形成與伸長階段對照組POD活性高于處理組，是為了減少IAA的消耗，從而能促進根的生長和伸長。

本試驗首先研究了植物生長調節劑對墨西哥落羽杉生根的影響，最終墨西哥落羽杉的生根率可達到92.8%，較之前張春英等的研究提高了6.8%[3]。觀察墨西哥落羽杉的生根過程后，用顯微鏡觀察根系的解剖結構，發現其屬于愈傷組織生根型。同時發現植物生長調節劑GGR可以動態調節內源激素及酶的活性，使其相互協作而處在有利于墨西哥落羽杉生根的動態平衡中。