翻埋與覆蓋林木枝條對干旱區沙化土壤及紫花苜蓿根系叢枝菌根真菌的影響

王博，張茹，劉靜，李志剛*

（1.寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏草牧業工程技術研究中心，寧夏 銀川 750021；3.寧夏師范學院數學與計算機科學學院，寧夏 固原 756000）

土壤退化在全球干旱半干旱地區普遍發生，而沙化是最主要的土地退化類型之一，也是影響全球生態和社會經濟最嚴重的問題之一［1］。據此，國內外就覆蓋或者有機物料添加措施進行土壤水分保持和土壤養分提高方面展開了大量研究，常見的措施有秸稈還田覆蓋［2］、礫石覆蓋［3］、地表覆膜覆蓋［4］、有機物料（秸稈、有機肥等）添加［5］及凋落物返還等。作為沙化地區生態環境和農田的主要保護屏障-生態防護林和農田防護林在我國北方干旱半干旱地區廣泛分布［6］，因而近年來學者們在利用林木廢棄物/修剪物進行沙化土壤改良方面也開展了大量研究，而且表明林木枝條翻埋或覆蓋可以顯著改善土壤水分條件［7］、提高土壤養分［8］、促進植物生長［9-10］，同時也改善了微生物的群落結構和功能［11］。然而，目前還缺乏林木枝條改良對土壤及植物根系叢枝菌根真菌影響的研究。

叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是陸地生態系統分布最廣泛的互惠共生菌之一，可以與超過80%的陸生植物根系形成共生關系［12］。AM真菌對植物生長及土壤養分循環具有重要作用，包括提高植物對水分及碳、氮、磷等養分的吸收利用，促進土壤氮、磷循環［13］，增強植物對環境壓力（營養缺乏、干旱、土壤退化）的耐受性［14-16］。Aguilar等［17］研究發現，施用有機肥料會刺激菌根的形成，并增加AMF的多樣性［18］。Alguacil等［19］研究還表明，土壤中添加作物秸稈亦促進了土壤中AM真菌多樣性和生物活性，并且AM真菌微生物多樣性及生物活性與土壤質量的改善呈正相關。因此，推測翻埋與覆蓋林木枝條可能對AM真菌的侵染率和多樣性的提升亦具有促進作用，同時AM真菌侵染率和多樣性的提高對土壤性質的改善及植物生長的促進亦具有積極作用，然而這方面的研究報道較少。據此，在本研究團隊前期試驗的基礎上［7-11］，本研究進一步探討翻埋與覆蓋林木枝條對干旱區沙化土壤及植物根系AM真菌侵染率及多樣性的影響，同時分析AM真菌侵染率及多樣性與土壤性質及植物生長間的關系，旨在為該地區沙化土壤改良及可持續利用提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

研究區位于賀蘭山東麓的銀川腹部沙地（106°08′-107°22′E、38°28′-38°42′N），屬于干旱半干旱過渡區，溫帶大陸性氣候，降水稀少且時空分布不均，年平均氣溫10.1℃，極端最高氣溫39.6℃，極端最低氣溫-27.9℃。年平均降水量181.2 mm，且大部分集中于7-9月。年平均蒸散量為2139 mm。土壤質地粒徑分布為92.5%砂、5.48%粉土、2.02%粘土，有機質含量為2.01 g·kg-1。土壤的pH為9.07。研究區主要植物種有豬毛蒿（Artemisia scoparia）、黑沙蒿（Artemisia ordosica）、賴草（Leymus secalinus）、蟲實（Corispermum hyssopifolium）、中亞白草（Pennisetum centrasiaticum）等。天然植被類型為荒漠草原，但目前農田防護林分布面積較大。另外，紫花苜蓿（Medicago sativa）是該地區畜牧業發展需要的重要牧草，被廣泛種植。

1.2 試驗設計

1.2.1 樣地布置 該試驗于2011年完成樣地布置。在研究區選擇平坦且土壤條件具有代表性的地塊進行試驗。本研究采用隨機區組試驗設計，每個區組設置4個處理：1）地表覆蓋粉碎長度約為1 cm的楊樹（Populus alba）枝條，厚度3～4 cm（M）；2）將粉碎長度約1 cm的楊樹枝條以5%的比例（質量比）翻埋至0～20 cm深的土層中（W）；3）在（2）處理的基礎上覆蓋長度為1 m左右的楊樹枝條，厚度為30 cm，覆蓋地表面積約60%（WB）；4）以不做任何添加為對照（CK）。以上每個處理重復5次（5個區組），總計20個試驗小區，每個試驗小區面積為3 m×3 m。以上M和W的處理方式雖然不同，但是添加量均相同，換算為總氮和總磷添加量，則均相當于添加外源氮和磷分別為0.156 g·kg-1和0.019 g·kg-1。

在本試驗期間，2011-2014年未種植紫花苜蓿，旨在觀測無植物種植下土壤性質變化；2015年種植紫花苜蓿，苜蓿以15 cm行距進行條播，播量為1.11 g·m-2，播前覆蓋處理移去覆蓋物，待苜蓿幼苗長至10 cm左右將覆蓋物復原。播前每個小區土壤施尿素21 g·m-2、磷酸二氫銨11 g·m-2。本研究在試驗處理后的第8年進行取樣測定AM真菌相關指標及土壤相關指標。

1.2.2 土壤及紫花苜蓿根系取樣 每個小區用滅菌的土鉆采用“S”形取樣法進行3次重復土壤采樣，采集深度為0～20 cm，混勻后剔除其中雜質，過2 mm篩，均勻分成3部分，一部分裝入無菌塑封袋且暫存于冷藏箱中用于土壤酶活性的測定；另一部分裝入標記好的滅菌離心管中用于叢枝菌根真菌測序；其余土樣帶回實驗室風干用于土壤理化性質的測定。同時，利用鐵鍬按照破壞性取樣的方法采集0～20 cm苜蓿根樣，每個小區苜蓿根樣采集位置同土壤采集位置。將采集的根系剪下毛根并沖洗干凈，一部分裝入無菌離心管中，送樣進行叢枝菌根真菌測序，另一部分保存在FAA固定液中，用于菌根侵染狀況的測定。

1.2.3 測定指標及方法 2019年8月收獲試驗小區當年紫花苜蓿地上部分，在85℃下烘干記為地上生物量。土壤水分采用烘干法測定（105℃烘24 h）。土壤pH、有機碳、全氮、全磷、無機氮、速效磷的測定均參考鮑士旦［20］《土壤農化分析》中的相關方法，脲酶活性、堿性磷酸酶活性、蔗糖酶活性和過氧化氫酶活性的測定方法參考關松蔭［21《］土壤酶及其研究法》，菌根侵染率采用醋酸墨水染色-網格交叉法測定［22］，土壤孢子數采用濕篩傾析-蔗糖離心法測定［23］。

1.2.4 根系及土壤AM真菌的測序 取20條根系樣品，采用CTAB法［24］提取根系DNA；取0.5 g冷凍土樣，利用試劑盒（TIANamp Soil DNA Kit）進行微生物DNA提取，提取過程嚴格遵照試劑盒操作說明進行。之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和濃度，并取適量樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng·μL-1。

選用特異性引物AML1/AML2［25］與AMV4.5NF/AMDGR［26］進行嵌套式PCR（nested PCR）擴增，擴增后的PCR產物使用1×TAE濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳進行純化，切膠回收目標片段。然后交由上海派諾森生物科技有限公司克隆測序。

1.3 數據處理

利用SPSS 24.0進行處理間土壤性質、苜蓿生物量、酶活性及土壤孢子數量的單因素方差分析，同時分別對土壤和根系AM真菌α多樣性進行處理間單因素方差分析；而處理間菌根侵染率數據采用Kruskal-Wallis檢驗進行差異分析。α多樣性指數（Shannon和Simpson指數）和豐富度指數（Chao1和ACE指數）根據高通量測序結果獲得的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）數據計算獲得。以下指標采用R進行統計分析：利用Pearson相關性進行因子間關系分析；利用基于Bray-Curtis距離的非度量多維測度分析（non-metricmultidimensional scaling，NMDS）及置換方差分析（permutational MANOVA，PERMANOVA）比較處理間AM真菌的β多樣性變化；利用基于距離的冗余分析（distance-based redundancy analysis，dbRDA）進行AM真菌群落結構與因子間關系的分析。

2 結果與分析

2.1 翻埋與覆蓋對紫花苜蓿生物量及土壤性質的影響

林木枝條3種處理方式均顯著提高了紫花苜蓿地上生物量（表1），即WB、W和M處理下紫花苜蓿的生物量分別是CK紫花苜蓿生物量（227.48 g·m-2）的1.77倍、1.60倍和2.29倍（P＜0.05）。然而，土壤水分僅有處理WB顯著高于CK（P＜0.05），同時WB土壤水分亦顯著高于W（P＜0.05）。此外，WB處理下土壤pH值顯著低于CK（P＜0.05），但林木枝條的3種處理方式間的pH值差異不顯著（P＞0.05）。對土壤養分的分析結果表明（表1），林木枝條的3種施用方式均不同程度地提高了土壤養分，且總體上以WB在處理間表現出最佳的趨勢。脲酶、堿性磷酸酶和蔗糖酶活性在處理間的變化與養分變化類似，亦以WB處理下土壤中3種酶活性最高，但過氧化氫酶活性在處理間差異不顯著（P＞0.05）。

表1 翻埋與覆蓋對土壤性質及紫花苜蓿地上生物量的影響Table 1 Effects of incorporated and mulched tree branches on soil properties and aboveground biomass of alfalfa

2.2 翻埋與覆蓋對紫花苜蓿根系AM真菌侵染狀況及土壤孢子數量的影響

根系總侵染率、叢枝侵染率、菌絲侵染率、泡囊侵染率及土壤孢子數在處理間均表現出WB＞M＞W＞CK的趨勢（圖1），且以上指標在WB處理下的值均分別顯著高于CK（P＜0.05），同時WB處理下的叢枝侵染率和泡囊侵染率均分別顯著高于W處理（P＜0.05）。相關性分析顯示（圖2），根系總侵染率、叢枝侵染率、菌絲侵染率、泡囊侵染率及土壤孢子數均與紫花苜蓿生物量、土壤水分、土壤養分及酶活性（除過氧化氫酶外）間呈正相關，而與pH值呈負相關（P＜0.05）。

圖1 翻埋與覆蓋對苜蓿根系叢枝菌根真菌侵染率和土壤孢子數的影響Fig.1 Effects of incorporated and mulched tree branches on arbuscular mycorrhizal fungi infection rate of alfalfa and soil spore number

圖2 叢枝菌根真菌侵染狀況與土壤因子間的相關性分析Fig.2 Correlation analysis between arbuscular mycorrhizal fungi infection and soil factors

2.3 翻埋與覆蓋對AM真菌α多樣性的影響

研究結果顯示（表2），翻埋與覆蓋對土壤AM真菌α多樣性均無顯著影響（P＞0.05）。然而，與CK相比，處理WB顯著提高了根系AM真菌的Chao1指數和ACE指數（P＜0.05），但其他處理的α多樣性指標與CK間對應指標的差異均不顯著（P＞0.05）。相關性分析表明（表3），土壤AM真菌α多樣性與苜蓿生長及土壤因子無顯著相關性（P＞0.05），但根系Chao1指數和ACE指數與無機氮、堿性磷酸酶和蔗糖酶活性均呈顯著正相關（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 翻埋與覆蓋對沙化土壤與根系AM真菌α多樣性的影響Table 2 Effects of incorporated and mulched tree branches on α-diversity of arbuscular mycorrhizal fungi in soils and alfalfa roots

表3 AM真菌α多樣性與苜蓿生物量及土壤因子間的相關性Table 3 Correlation between α-diversity of AM fungi with alfalfa biomass and soil property

2.4 翻埋與覆蓋對AM真菌β多樣性的影響

PERMANOVA與NMDS分析結果表明，WB處理下的土壤AM真菌群落結構與CK、M及W間均存在顯著性差異（P＜0.05），同時W和CK間土壤AM真菌群落結構亦顯著不同（P＜0.01，圖3a）。然而，處理間根系AM真菌的群落結構不同于土壤，即只有WB和M間的AM真菌群落結構差異顯著（P＜0.05，圖3b）。dbRDA分析表明（圖4），土壤中的AM真菌群落結構與紫花苜蓿地上生物量、全磷含量、無機氮含量、脲酶活性及蔗糖酶活性顯著相關（P＜0.05或P＜0.01，圖4a），而根系AM真菌群落結構和紫花苜蓿地上生物量、有機碳含量、無機氮含量、速效磷含量及過氧化氫酶活性顯著相關（P＜0.05或P＜0.01，圖4b）。據此，紫花苜蓿地上生物量和無機氮含量是同時影響土壤和根系中AM真菌群落結構的主要因子。

圖3 AM真菌群落結構在土壤（a）和根系（b）中NMDS與PERMANOVA分析Fig.3 NMDS and PERMANOVA analysis of arbuscular mycorrhizal fungi community structure in soil（a）and root（b）

圖4 土壤（a）與紫花苜蓿根系（b）中AM真菌群落結構與因子間的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis between community structure of arbuscular mycorrhizal fungi and its factors in soil（a）and root（b）respectively

3 討論

3.1 翻埋與覆蓋對紫花苜蓿根系AM真菌侵染率及沙化土壤孢子數的影響

AM真菌在植物根系的侵染定殖與土壤理化因子有關［27］。本研究表明，紫花苜蓿根系總侵染率、叢枝侵染率、菌絲侵染率、泡囊侵染率及土壤孢子數均與土壤水分、土壤養分及酶活性間呈正相關，而與pH呈負相關。馮固等［28］研究發現，AM真菌侵染率及產孢能力隨土壤養分的變化而有所不同。同樣在本試驗中，與CK相比，由于林木枝條翻埋+覆蓋處理（WB）下的土壤水分、養分含量及酶活性（過氧化氫酶除外）較其他處理最高，而pH最低，致使WB處理下的紫花苜蓿根系AM真菌侵染率和土壤孢子數亦最高，說明WB處理可以有效促進AM真菌在土壤和植物中的侵染定殖。同時，AM真菌在植物根系侵染率的提高也會促進植物的生長［13］，而且本研究結果顯示紫花苜蓿地上生物量與菌根侵染率及孢子數之間存在顯著正相關。此外，李勝寶等［29］的研究結果表明，AM真菌可以促進土壤中添加秸稈的降解，利于土壤養分含量的提高。因此，WB處理由于改善了土壤水分條件，將更有利于促進包括AM真菌在內的微生物對林木枝條及土壤中其他有機物的分解，利于土壤有機碳及其他養分含量的提高。還有研究顯示，接種AM真菌顯著增加了土壤脲酶的活性及作物秸稈氮素的釋放量［30］，本研究結果中WB處理與其類似，因為WB處理方式顯著促進了AM真菌侵染，進而土壤脲酶活性得以提高及枝條氮素得以分解釋放。總之，與CK相比，WB處理在促進AM真菌侵染、土壤養分提高及植物生長方面均具有積極的作用，是未來干旱半干旱區沙化土壤可供選擇的一種措施。

在黃土高原旱作農田的研究表明，秸稈覆蓋亦能顯著提高土壤AM真菌的豐富度（AM真菌種數）［31］，但也有秸稈覆蓋可增加或降低AM真菌侵染率的研究結果［32］。本研究表明，林木枝條覆蓋雖然沒有顯著影響紫花苜蓿根系總侵染率、叢枝侵染率、菌絲侵染率、泡囊侵染率及土壤孢子數，但覆蓋措施總體上表現出促進AM真菌侵染率的趨勢。此外，由于WB處理中長枝覆蓋遮蔭對紫花苜蓿的生長具有一定的抑制作用［10］，導致紫花苜蓿地上生物量在覆蓋處理（M）下高于WB處理，這也可能是M處理表現出能夠促進AM真菌侵染率的原因，因為相關性分析亦表明紫花苜蓿生物量與AM真菌侵染率顯著正相關。此外，還有研究表明，秸稈覆蓋可以促進AM真菌類群中腐生營養型真菌豐度的升高，有助于土壤養分的提升［33］，而且土壤中添加作物秸稈并接種AM真菌處理能不同程度地增加土壤養分和植物生物量［34］。本研究結果顯示，與CK相比，雖然翻埋林木枝條處理（W）對土壤養分含量和酶活性亦具有促進作用，但是W處理下的紫花苜蓿生物量及土壤水分含量與CK無顯著差異，這可能也是處理W未能顯著促進AM真菌侵染率的原因。總之，處理間AM真菌的侵染率總體表現為WB＞M＞W＞CK的趨勢，特別是WB可以顯著改善土壤水分條件，同時為植物生長和AM真菌定殖創造有利條件，而AM真菌的成功定殖又為促進植物的生長進一步創造了有利條件。

3.2 翻埋與覆蓋對沙化土壤及紫花苜蓿根系AM真菌群落結構的影響

前人關于秸稈還田的研究結果表明，翻埋秸稈可以顯著提高AM真菌物種豐富度和多樣性指數，但對β多樣性的影響不顯著［35］，但也有秸稈還田對AM真菌β多樣性的影響顯著的研究實例［36］。還有研究顯示秸稈和有機肥翻埋顯著提高了AM真菌物種豐富度和多樣性指數，并同時改變了β多樣性［5］。因此，有機物料添加對AM真菌α多樣性及β多樣性的影響可能還與被改良的土壤性質有關。在本研究中，雖然翻埋+覆蓋處理（WB）顯著提高了根系AM真菌的Chao1指數和ACE指數，但翻埋（W）或覆蓋（M）處理對土壤及植物根系α多樣性無顯著影響。李雪靜等［37］發現土壤中有機質、全碳、全氮及水分條件均顯著影響AM真菌的多樣性。然而，本研究相關分析的結果表明，WB與CK相比由于顯著提高了土壤無機氮含量及促進了堿性磷酸酶與蔗糖酶活性，因而提高了Chao1指數和ACE指數，說明無機氮在高C/N林木枝條添加下對AM真菌α多樣性的影響更為重要。Li等［9］的前期研究也發現，利用高C/N林木枝條改良土壤時短期內會造成土壤C/N的失衡，使得提高無機氮含量成為林木枝條改良土壤時需要注意的重要因素。然而，本研究結果表明，在林木枝條改良8年后的土壤中，其無機氮含量均顯著高于CK，而且3種林木枝條改良措施中以WB處理下的土壤無機氮含量最高。因此，WB處理對根系AM真菌的Chao1指數和ACE指數的提高與該處理下土壤中無機氮含量亦最高密切相關。此外，AM真菌α多樣性與酶活性間的顯著正相關說明AM真菌α多樣性的提高與土壤微生物活性呈正相關，這與Alguacil等［19］的研究結果類似，進一步說明3種林木枝條改良方式中，WB處理的土壤脲酶、堿性磷酸酶及蔗糖酶活性最高亦與其AM真菌α多樣性最高密切相關。因此，WB處理較M和W更有利于促進土壤AM真菌α多樣性及其活性，利于干旱半干旱地區土壤的改良。

本研究β多樣性分析結果顯示，WB處理下土壤AM真菌群落結構與CK、W及M均出現顯著分離，WB處理下的紫花苜蓿根系AM真菌群落結構與CK亦出現顯著分離，說明翻埋+覆蓋的組合處理顯著改變了土壤及植物根系中AM真菌的群落結構。進一步的研究表明，紫花苜蓿地上生物量和無機氮含量是同時影響土壤和根系中AM真菌群落結構的主要因子，說明紫花苜蓿與AM真菌之間存在協同互利的關系，這與接種AM真菌可以促進植物生長的研究結果類似［38］。然而，前人的研究已表明，AM真菌在磷素循環中扮演著重要作用，可分泌大量磷酸酶活化有機磷，并通過菌絲吸收和運輸磷的過程促進植物對無機磷的吸收［39］，本研究中土壤無機氮與AM真菌群落間的關系更為密切的結果與其不一致，進一步說明無機氮是林木枝條改良土壤過程中對AM真菌影響最主要的因子之一。此外，Li等［9］前期研究也表明，在高C/N林木枝條添加下土壤中的氮素可能對植物及微生物生長更為重要，因而無機氮也顯著影響了AM真菌的群落結構，這與Liu等［5］利用秸稈改良土壤的研究結果類似。RDA模型結果還顯示紫花苜蓿地上生物量和無機氮含量是同時影響土壤和根系中AM真菌群落結構的主要因子，這進一步說明AM真菌與植物生長之間存在顯著的正相關。同時，Shu等［40］利用不同有機改良劑研究亦發現，微生物多樣性和群落結構與作物產量呈顯著正相關，說明土壤微生物多樣性是通過提高土壤微生物功能來驅動作物產量的重要因子。因此，綜合分析，WB不僅可以顯著改善AM真菌的群落結構和功能，而且為AM真菌與紫花苜蓿的共生創造了有利的條件，促進了紫花苜蓿的生長。

4 結論

與翻埋（W）和覆蓋（M）相比，翻埋與覆蓋的處理組合（WB）在土壤及植物根系AM真菌的侵染定殖以及AM真菌群落結構與活性的改善方面均具有顯著的促進作用，表現出3種林木枝條處理方式中以翻埋與覆蓋的處理組合下的AM真菌侵染率最高、土壤孢子數最多及α多樣性較高，而AM真菌活性的提高又促進了土壤碳氮等養分的循環和植物的生長。因此，翻埋與覆蓋的處理組合作為將來干旱半干旱地區沙化土壤改良的一種措施是可行的，具有一定的推廣應用價值。