野牛草雌雄株對不同形態氮素的生理響應差異

郭麗珠，孟慧珍，2，范希峰，滕珂，滕文軍，溫海峰，岳躍森，張輝，武菊英*

（1.北京市農林科學院草業花卉與景觀生態研究所，北京 100097；2.西北大學生命科學學院，陜西 西安 710069）

由于長期的適應性進化和雌雄性別的分株表達，雌雄異株植物在生長特性、生理生化特征、資源分配、生殖格局和基因表達特性等方面具有一定的性別差異［1-3］。這些差異往往造成雌雄異株植物不同性別的植株對環境適應性不同，且使雌雄植株能在環境中分別獲取各自最需要的資源進行營養生長與生殖活動，進而提高種群整體的繁殖率及種群對環境的適應性［4-6］。野牛草（Buchloe dactyloides）原產于北美中部溫帶和亞熱帶半干旱地區，是一種少有的雌雄異株草坪植物，其抗寒抗旱能力強、繁殖迅速、維護需求低，在我國引進后廣泛應用于水土保持和園林綠化［7］。野牛草具有雌株、雄株及雌雄同株3種性別，不同性別植株的區分只有在進入生殖生長階段才能進行分辨［8］。野牛草雌、雄株在匍匐莖生長能力［9］、對銹病的抗性［10］及不同生長階段的保水能力［11］都存在顯著的性別差異，這種差異勢必影響不同性別野牛草植株的坪用性狀有所不同。由于不同性別的植物具有不同的經濟價值，因此研究雌雄異株植物在環境條件變化下的響應差異具有重要的生產實踐意義，為有目的地選擇具有經濟、觀賞等價值的雌雄異株植物的性別提供理論參考。

施肥是保障草坪草正常生長、維持和提高草坪質量的重要措施［12-13］。硝態氮（NO3--N）和銨態氮（NH4+-N）是植物可以直接從土壤中吸收和利用的兩種主要無機氮素形態［14-15］，不同氮素形態不僅影響植物的形態建設、光合作用、根系生長［16-18］，對植物氮素代謝途徑中關鍵酶活性及相關基因表達也會產生影響［19］。植物對氮素的吸收主要是通過根系完成的，植物根細胞吸收NO3--N后，首先在根系中被硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）和亞硝酸還原酶（nitrite reductase，NiR）同化為NH4+，進而被同化為氨基酸和蛋白質。與吸收NO3--N不同，植物吸收NH4+-N后，直接在谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）/谷氨酸合成酶（glutamate synthase，GOGAT）循環反應的催化下形成谷氨酰胺。不同植物種類對氮素營養環境的長期適應形成對不同氮源的偏向選擇性，并形成了不同的氮素利用分配策略。研究表明，硝態氮作為唯一氮源能夠增加谷類作物的分蘗數［20］，山核桃幼苗（Carya illinoinensis）在生長過程中表現出對銨態氮的優先吸收［17］，而黃瓜（Cucumis sativas）在以銨態氮或高比例的銨態氮作為氮源時會受到明顯的生長抑制［21］，當氮肥中硝態氮的比例較高時則會促進甜椒（Capsicum annuum）、韭菜（Allium tuberosum）、芹菜（Apium graveolens）等作物的生長［22-24］。大量研究表明農作物對氮素形態吸收具偏向選擇性，然而氮素形態影響草坪植物的研究十分有限［25-26］，因此亟須彌補不同形態氮肥在草坪植物野牛草施用研究上的空白。前人研究表明野牛草草坪綜合質量隨氮素用量的增加而提高［27-29］，但已有研究尚未從氮素形態角度出發探究野牛草對氮素的響應，且很少有研究區分野牛草雌雄株的表現差異，進而從性別差異的角度出發探究野牛草不同性別植株草坪建植中的氮肥管理差異。本研究以不同性別野牛草植株為試驗材料，研究不同形態氮素對野牛草雌、雄株在生長、生物量、葉綠素含量、葉片氮含量及氮代謝相關酶的影響，揭示野牛草不同性別植株對不同形態氮素的偏好，為人工建植野牛草單性植株草坪合理施氮、提高野牛草對氮的吸收和利用具有十分重要的理論和現實意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從野外選取長勢良好的野牛草雌、雄單株，通過分株克隆繁殖，獲得了大量遺傳背景一致、基因型相同的單性別無性系群體。試驗時選取生長狀態一致的距植株生長頂端第4個克隆分株（一般為8片葉子，圖1）進行扦插。

圖1 實驗對象選取示意圖Fig.1 Schematic diagram of experiment object selection

1.2 試驗設計

于2021年3月在北京市農林科學院智能溫室中進行盆栽試驗，盆栽試驗的盆缽上口直徑21 cm、底部直徑15 cm、高27 cm。每盆栽植野牛草雌株或雄株匍匐莖上的無性分株1株，以沒有營養成分的黃砂作為培養基質，每盆黃砂重3.5 kg。試驗設計4個氮素配比處理：1）不加氮處理（CK）；2）單一添加硝態氮N1（NO3--N）；3）單一添加銨態氮N2（NH4+-N）；4）混合態氮N3（NO3--N∶NH4+-N=1∶1），不同形態氮素的添加主要通過營養液的方式實現，營養液組成如表1所示。為防止試驗過程中硝化作用，在N2、N3處理的營養液中添加了硝化抑制劑雙氰胺（dicyandiamide，DCD），并通過鹽酸和氫氧化鈉將營養液的pH調至6.0左右。盆栽幼苗每5～7 d用500 mL營養液澆灌一次，每次澆灌營養液時隨機移動花盆位置，保證所有植株光照情況相同，直到試驗結束。每個處理12盆，每盆1株，不同性別野牛草植株共計96盆。植物生長3個月后試驗結束，收獲完整植株。首先采集部分葉片鮮樣，測定鮮重后用液氮冷凍保存于-80℃冰箱中用于測定后續生理指標；其次將剩余各部位用蒸餾水進行沖洗，擦干后進行殺青，后置于65℃烘箱中烘干至恒重。

表1 不同形態氮素處理的營養液配方Table 1 Nutrient solution composition of nitrogen form treatments（mmol·L-1）

1.3 試驗方法

1.3.1 生長性狀指標測定 植株收獲后每個處理選取12株測量生長性狀指標。匍匐莖長度（cm）：用直尺測量匍匐莖尖端到植株底部拉直長度；匍匐莖直徑（mm）：用游標卡尺測量從枝條底端開始第1、2、3段間隔子直徑，取平均值；匍匐莖節數：從枝條尖端到底端全部間隔子的數量；間隔子長度（cm）：從枝條底端開始第1、2、3段間隔子長度的平均值。

1.3.2 生物量指標測定 將野牛草雌株或雄株全株分為根、母株、匍匐莖（分株、間隔子），烘干后分別測量各部位生物量干重，并計算地下部分（根）和地上部分生物量（母株、分株、間隔子）以及各部位的生物量分配比例。

根生物量分配比例（%）=根生物量/（根生物量+母株生物量+分株生物量+間隔子生物量）×100

母株生物量分配比例（%）=母株生物量/（根生物量+母株生物量+分株生物量+間隔子生物量）×100

分株生物量分配比例（%）=分株生物量/（根生物量+母株生物量+分株生物量+間隔子生物量）×100

間隔子生物量分配比例（%）=間隔子生物量/（根生物量+母株生物量+分株生物量+間隔子生物量）×100

1.3.3 葉綠素含量的測定 稱取野牛草新鮮葉片0.1 g，剪碎后于10 mL乙醇/丙酮（體積比1∶1）混合液內避光浸泡提取18 h，之后使用酶標儀（Multiskan FC，美國）測定在665和649 nm波長下的吸光值。

葉綠素a含量（mg·g-1）=（13.95×A665-6.88×A649）×0.01/0.1

葉綠素b含量（mg·g-1）=（24.96×A649-7.32×A665）×0.01/0.1

總葉綠素含量（mg·g-1）=（6.63×A665+18.08×A649）×0.01/0.1

1.3.4 葉片氮含量的測定 采用碳氫元素分析儀（Elementar vario MACRO cube，德國）測定分株葉片的全氮（total nitrogen，TN）含量。

1.3.5 氮代謝相關酶活性測定 采用北京索萊寶（Solarbio）科技有限公司試劑盒測定硝酸還原酶（nitratereductase，NR）、谷 氨 酰 胺 合 成 酶（glutamine synthetase，GS）和 谷 氨 酸 合 成 酶（glutamate synthase，GOGAT）活性，用酶標儀（Multiskan FC，美國）在340，540和340 nm波長下測量吸光值并計算酶活性。

NR（U·g-1）=5.359×△A340÷W（△A340為反應30 min前后兩個吸光值的差值，W為樣品重量g）

GS（U·g-1）=38×△A540÷W（△A540為測定管與對照管的吸光值差值，W為樣品重量g）

GOGAT（U·g-1）=321.5×△A340÷W（△A340為反應5 min前后兩個吸光值的差值，W為樣品重量g）

1.4 數據處理

利用Microsoft Excel 2010對原始數據進行記錄整理。采用SPSS 21.0對數據進行分析，對不同形態氮素處理下野牛草雌雄株生長性狀、生物量及生物量分配、葉綠素含量、葉片氮含量及氮代謝相關酶活性的影響進行單因素方差分析（One-way ANOVA）并使用LSD法進行多重比較。使用Origin 2018作圖。

2 結果與分析

2.1 不同形態氮素對野牛草雌雄株生長性狀的影響

不同形態氮素處理對野牛草雌、雄株的生長性狀影響不同（圖2）。野牛草雌、雄株的間隔子長度都在N2、N3處理下顯著短于N1和CK，特別是在N2處理時野牛草雌、雄株的間隔子長度都是最短，分別為5.79和2.86 cm，而CK與N1之間沒有顯著差異。野牛草雌、雄株的間隔子直徑與間隔子長度表現相近。野牛草雌株的匍匐莖節數在N2和N3處理時，同樣顯著少于CK和N1，然而雄株匍匐莖節數在N1處理時顯著大于其他3種處理。野牛草雌株的匍匐莖長度在N2處理時最短（44.67 cm），而雄株匍匐莖長度在N1處理時顯著高于其他3種處理。

圖2 不同氮素形態對野牛草雌雄株生長性狀的影響Fig.2 Effects of nitrogen forms on growth traits of female and male buffalograss

2.2 不同形態氮素對野牛草雌雄株不同部位生物量及生物量分配的影響

由圖3可知，野牛草雌株子株、根的生物量在N1處理下顯著大于其他處理，而N1處理下母株和間隔子的生物量與CK沒有顯著差異但顯著大于其他形態氮素處理。雄株各部位生物量表現與雌株并不一致。雄株的母株生物量在N3處理下最小，子株、間隔子、根生物量在N1處理下最大，其中子株和間隔子的生物量在N1處理和N3處理間無顯著差異而根的生物量在N1處理時顯著大于N3處理。此外，野牛草雌株和雄株的地上生物量、地下生物量及總生物量均在N1處理時最大。其中雌株總生物量在CK時顯著大于N2和N3處理，但地上生物量和地下生物量在N2處理時顯著小于CK和N3處理；雄株總生物量在N2處理時顯著大于CK，但雄株地上、地下生物量在CK、N2、N3處理之間無顯著差異。野牛草雌、雄株均將生物量主要分配于子株。雌株的間隔子生物量分配在N3處理時顯著大于N1和CK處理，根生物量分配在N1時顯著大于N2；雄株的母株生物量分配在N1、N2處理時顯著大于N3，子株生物量分配在N3處理時顯著大于N2。

圖3 不同氮素形態對雌雄異株野牛草不同部位生物量的影響Fig.3 Effects of nitrogen forms on biomass in different parts of female and male buffalograss

2.3 不同形態氮素對野牛草雌雄株葉綠素、N含量的影響

從表2可以看出，不同形態氮素處理對雌株、雄株葉片氮含量的影響不同，雌株葉片氮含量在N3處理時顯著大于其他處理，而雄株在N1處理時最大。此外，不同形態氮素處理主要對野牛草葉片的葉綠素a含量及葉綠素總量的影響顯著。雌株、雄株的葉綠素a含量均在N1處理時顯著大于其他處理，雄株葉綠素a含量在CK時最低，雌株葉綠素a含量在CK、N2、N3之間無顯著差異。雌、雄株的總葉綠素含量在N1處理時均最高，但雄株在N1時顯著大于N3，而雌株在N1和N3處理之間無顯著差異。總的來說，無論差異顯著與否，野牛草雌、雄株的葉綠素含量均在N1處理時高于其他處理。

表2 不同形態氮素對野牛草雌雄株葉綠素含量、N含量的影響Table 2 Effects of nitrogen forms on chlorophyll and nitrogen content of female and male buffalograss（mean±SD）

2.4 不同形態氮素對野牛草雌雄株氮代謝相關酶活性的影響

如圖4所示，野牛草雌株的硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶及谷氨酸合成酶的活性均在N3處理時顯著大于其他處理，其中雌株的NR、GOGAT活性在N1處理時與CK無顯著差異、N2與CK有顯著差異而GS活性在CK、N1、N2處理之間無顯著差異。野牛草雄株NR活性在N1處理時顯著大于N2和CK處理，但與N3處理無顯著差異，GOGAT活性在N3處理時顯著大于CK但與N1和N2無顯著差異，GS活性在N1處理時顯著大于其他處理。

圖4 不同形態氮素對野牛草雌雄株氮代謝相關酶活性的影響Fig.4 Effects of different nitrogen forms on activities of nitrogen metabolizing enzymes in female and male buffalograss

3 討論

自Darwin［30］首次認識到雌雄異株植物的生殖差異將導致性別特化和對資源的不同需求以來，植物界中雌雄植株間的各種差異逐步引起人們的注意。野牛草是禾本科植物中少有的雌雄異株植物，性別分化使野牛草單性別植株草坪的建植成為可能。通常，野牛草進入花期后，雄株的花軸高于株叢，花粉成熟后草坪呈現明顯的黃色，因此雌株逐漸成了坪用型野牛草。此外，有研究表明野牛草雌株匍匐莖的生長能力要強于雄株［9］、對銹病的抗性更強［10］，因此建植野牛草純雌株草坪可能比現存混合性別草坪更具性價比。然而，早期學者更多地關注野牛草性別分化比例、性別形態學差異及性別決定等研究［10，31］，對野牛草響應不同環境條件的性別差異研究并不多。

氮肥是草坪草需要量最大的營養元素，在草坪植物的生長質量和產量形成中扮演著關鍵角色。前人研究結果表明，野牛草草坪綜合質量隨氮素用量的增加而提高［27-29］，而本研究發現，在野牛草克隆分株培養過程中N的施加效果并未像其他研究那么明顯。這主要是因為：與其他草坪草相比，野牛草是一種低養護、管理粗放的草坪草，其植株生長可能對N養分的豐缺在生長前期并不十分敏感；其次，本試驗中施用N素濃度并不高，進而導致N素的施加與對照對野牛草植株生長的影響差別不明顯。通常，氮肥對維持和改善草坪質量的作用效果除與施用量有關外［32-33］，還受氮素形態的影響［26］。大量研究表明，植物對不同形態氮素的偏好性首先表現為生物量積累的差異［34］，這可能是因為植物對不同形態氮素的偏好性與植物的光合能力對不同形態氮素響應差異有關。本研究發現野牛草雌株或雄株均在硝態氮處理（N1）時其總生物量、地上生物量、地下生物量都顯著最大，表明野牛草雌、雄株的生長均偏喜硝態氮。盡管如此，野牛草雌、雄株在響應銨態氮作為唯一氮源時的表現卻不一致，雌株的地上、地下生物量在銨態氮處理時均顯著小于銨硝混合氮處理及對照，而雄株反應不明顯，這表明野牛草雌株在以銨鹽為唯一氮源的情況下可能產生銨鹽毒害癥狀。通常，NH4+-N抑制植物生長主要與供應NH4+-N導致養分（如K+、Ca2+、Mg2+等陽離子）的吸收減少有關，進而打破植物細胞內的離子平衡［35-36］。此外，本研究還發現氮素形態對野牛草生長性狀的影響與其生物量結果表現相近。

植物生長代謝、光合作用和同化物質的基礎之一是葉綠素，在一定程度上，葉綠素含量與光合作用的強度關聯密切。氮素形態幾乎影響了光合作用的各個環節，包括通過影響葉片葉綠素含量、光合速率、暗反應主要酶活性以及光呼吸等，直接或間接影響光合作用。相比對照處理，施氮可提高野牛草雌、雄植株葉綠素含量，其中葉綠素a含量變化比葉綠素b更加明顯。硝態氮處理（N1）時野牛草雌、雄株的葉綠素a含量都顯著大于CK，說明硝態氮處理顯著提高了野牛草的光合作用，有利于光合產物的積累，從而促進其生物量的積累；而銨態氮或銨硝混合態氮處理對葉綠素a含量的影響效果相較CK并不顯著。銨態氮營養對葉綠素的增加影響小的原因可能是銨離子在體內積累，產生毒害作用，從而破壞類囊體結構，導致質子形成受阻，且易形成氧化磷酸化，破壞碳水化合物的形成，降低植物的光合特性［37］。此外，氮素是葉綠素分子結構的構成要素，供應充分才能保證葉綠體形成和累積，提高葉綠素含量。野牛草雌株葉氮含量在銨硝混合態氮（N3）處理時顯著大于單一氮形態處理，表明在銨態氮中加入硝態氮可以緩解銨態氮對野牛草雌株生長的抑制作用，而混合態氮對雄株的影響沒有雌株明顯。

氮代謝是植物生命活動和生長發育必不可少的代謝活動之一，而硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）是植物體內從無機氮變為有機氮過程中最重要的氮代謝相關酶［19］。NR活性大小表示氮代謝能力的強弱，故它在整個植物氮代謝的過程中起到關鍵調控作用。影響NR活性的因素有很多，一方面該酶活性高低會隨底物濃度的升高而增加，即NR活性受硝酸鹽的正向調節；另一方面也有研究認為作物在銨硝混合施用時的NR活性比單一NO3--N營養高，氮素代謝強［38］。本研究結果顯示野牛草雄株的NR活性在硝態氮處理時最大，而雌株卻在混合態氮處理時最大，表明影響野牛草雌、雄株NR活性的因素并不一致。此外，GS是植物氮素同化中的另一個重要酶類，和GOGAT共同完成氨的初始同化。在GS作用下，NH4+和谷氨酸反應形成谷氨酰胺，然后由GOGAT催化谷氨酰胺與а-酮戊二酸作用形成兩分子的谷氨酸，其中一分子的谷氨酸作為GS的底物繼續同化NH4+，另一分子谷氨酸可用于合成蛋白質、核酸等含氮化合物［39］。GS對NH4+有高度親和性，可以使植物避免銨積累所造成的毒害［40］。野牛草雌株在混合態氮（N3）處理時其GS活性最大，這可能是由GS催化形成的產物谷氨酰胺能夠反饋抑制GS活性，由于雌株對銨敏感、NH4+處理對雌株GS的活性可能產生了下調作用。然而，并非所有植物GS基因都是由NH4+誘導的，NO3-亦能誘導GS基因的表達［41］。野牛草雄株GS活性在硝態氮處理時達最大，這與其植株體內可能存在不受銨態氮調控的GS相關基因表達有關。GOGAT也是谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶循環途徑中起催化作用的關鍵酶，野牛草雌株在混合氮處理時其GOGAT活性顯著大于單一硝態氮或銨態氮處理，說明混合氮處理可以減輕銨態氮對雌株的銨毒作用；而雄株GOGAT活性在3種形態氮處理下無顯著差異，表明雄株在硝態氮處理下仍可以保持與銨態氮或混合氮處理時相近的GOGAT活性，確保外源NO3-被植物根系吸收后通過木質部運到葉中還原為NH4+而被GS/GOGAT循環同化。總的來說，雌株的氮代謝相關酶在N3處理時均最高，而雄株則是在N1處理時最大，該結果與葉片N含量的結果一致。

4 結論

綜上，野牛草雌、雄株的生長均偏喜硝態氮，雌株對銨態氮作為唯一氮源異常敏感而雄株反應不明顯。野牛草雌雄株對不同形態氮素的響應存在明顯差異，可為人工建植野牛草單性植株草坪合理施氮、提高野牛草對氮的吸收和利用提供科學依據。