間充質干細胞來源的外泌體治療哮喘的研究進展

索睿，郝天旭，茹仙古麗·吾買爾綜述，趙曉赟審校

（天津醫科大學胸科臨床學院，天津 300222）

哮喘是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應性為特征的異質性疾病，氣道重塑在哮喘疾病進展中扮演著重要角色，主要以支氣管平滑肌肥大/增生、氣道上皮細胞黏液化生、上皮下膠原沉積和纖維化、血管增生以及基底膜增厚為特征。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在改善哮喘氣道重塑中的療效已經得到證實，其分化替代功能一直被認為是參與損傷組織修復的主要方式，但近年來研究發現MSCs 旁分泌釋放的外泌體（exosome，EXO）同樣發揮了治療作用。MSCs 來源的外泌體（MSCs-EXO）是細胞間通訊的媒介，可傳遞生物活性脂質、核酸和蛋白質，雖然已被證實具有抗炎、免疫調節及促進組織修復和再生等作用，但目前在療效上仍存在爭議，未廣泛應用于臨床。本文對MSCs-EXO改善哮喘氣道重塑的研究進展進行了綜述，為后續研究提供參考。

1 哮喘概述

哮喘是一種常見的慢性呼吸系統疾病，以氣道高反應性（AHR）、氣道炎癥和氣道重塑為特征[1]。氣道重塑通過基底膜增厚、細胞外基質沉積、氣道平滑肌細胞異常生長等多方面過程參與哮喘進展[2-3]。哮喘的臨床特征主要表現為反復發作性喘息、呼吸困難、胸悶或咳嗽（咳嗽變應性患者可無喘息），常表現為可變性呼氣氣流受限。哮喘在世界范圍內發病率越來越高，全球有3 億哮喘患者，近年來由于人口和環境問題等原因，情況有所惡化[4]。目前哮喘的治療主要以吸入糖皮質激素和擴張支氣管等對癥處理為主，但仍有至少15.5%的哮喘患者發作時需急診就診，7.2%的患者需要住院進一步治療[5]。吸入糖皮質激素能有效控制大多數嗜酸性粒細胞型哮喘患者的癥狀，但中性粒細胞型類固醇抵抗性哮喘仍然是目前哮喘治療的重大挑戰。探索新的有效治療方法來“根治”哮喘，更好地管理糖皮質激素反應不良或無反應哮喘患者是當務之急。

2 MSCs 在哮喘治療中的應用

2.1 MSCs 概述 MSCs 又被稱為多功能間質細胞，可來源于脂肪、骨髓、臍帶血、羊水、牙髓等多種組織，早在1990 年就被研究人員認識并逐漸被熟知。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）、臍帶間充質干細胞（umbilical cordmesenchymal stem cells，UCB-MSCs）和脂肪組織間充質干細胞（adipose tissuemesenchymal stem cells，AD-MSCs）是MSCs 的主要來源[6]。盡管不同組織來源的MSCs 在表型和功能特性上有所不同，但根據國際細胞治療學會定義的最低標準：MSCs 表達CD29、CD90、CD73、CD105、CD71、CD271，而不表達CD14、CD34、CD45 和人白細胞抗原DR（human leukocyte antigen DR，HLA-DR）；具有黏附性；并具有分化成脂肪細胞、成骨細胞等中胚層細胞系的能力[7]。MSCs 不僅具有組織修復能力、免疫抑制特性，并且可以釋放許多生物因子，故在過敏性疾病中發揮關鍵作用[8]。MSCs 還具有低免疫原性[9]。由于MSCs 上主要組織相容性復合體（major histocompatibilty complex，MHC）Ⅱ類分子、Fas 配體（Fas L）和T 細胞共刺激分子低水平表達，故其更容易逃避免疫系統的攻擊[10-11]。因此，異種異體MSCs 的應用成為可能。

2.2 MSCs 在哮喘治療中的作用 近年來，有關MSCs改善哮喘氣道重塑和延緩哮喘病情進展的報道逐漸增多。MSCs 具有良好的組織修復、炎癥抑制和免疫調節功能。Knight 等[12]研究表明，MSCs 可直接分化為氣道上皮細胞，發揮正常氣道上皮細胞的功能，以改善哮喘引起的呼吸道損傷。Li 等[13]認為在卵清蛋白（ovalbumin，OVA）致敏大鼠尾靜脈中植入胎盤源性間質干細胞，可以促進叉頭盒蛋白P3（forkhead box P3，Foxp3）和白細胞介素（IL）-10 的產生來增加調節性T 細胞（regulatory T cells，Tregs）的數量，同時抑制RAR 相關孤兒受體γ（RAR-related orphan receptor γ，RORγt）和IL-17 的產生以減少輔助性T 細胞（Th）17 的數量，從而改善哮喘的炎癥。有研究將胎盤MSCs 經尾靜脈注入小鼠體內，結果顯示支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞減少，Th2細胞因子IL-4 水平降低，其下游B 細胞分泌IgE受到抑制。隨著這些變化，杯狀細胞的增殖和黏液的合成接近正常水平，淋巴細胞向Th2 的極化被中斷[14]。雖然MSCs 療法可以有效抑制氣道炎癥、改善哮喘小鼠的肺功能、修復重塑的氣道，但該法仍存在一定的局限性：若體外擴增和培養條件不當，仍可引起全身炎癥反應，甚至可激活補體途徑，誘導血栓形成；MSCs 的長期體外培養會導致其干性下降，增殖分化能力下降，甚至壽命縮短；另外，有研究顯示MSCs 移植后，小鼠形成肉瘤的風險可能增加[15]。因此，攜帶生物活性成分的EXO 受到廣泛的關注，有望成為MSCs 的替代療法。

3 MSCs-EXO 在哮喘治療中的應用

3.1 MSCs-EXO 概述 EXO 是由多泡體與細胞膜融合而釋放的細胞外囊泡，直徑約30～150 nm，作為細胞間通信的媒介，通過轉運核酸（miRNA、mRNA、DNA）、蛋白質、酶和代謝產物，從而改變靶細胞的生物學功能，在過敏性氣道疾病進程中發揮關鍵作用[16]。EXO 也是MSCs 分泌途徑的重要組成部分，可發揮與其母體相似的治療效果，通過攜帶重要的細胞因子，調節免疫應答和細胞生物學功能[17]。BMMSCs 是制備EXO 的最常用細胞來源，但近幾年有研究表明，誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）衍生的MSCs 在表型和功能上與成人MSCs 相似[18]，并表現出更高的增殖潛力、更長的生存時間、更強的免疫特性和更低的異質性[19]，這使它們成為大規模制備EXO 的理想細胞來源。與基于MSCs 的細胞治療相比，MSCs-EXO 的無細胞治療具有免疫原性低、儲存方便、生物安全性高等優點。且因為它們不能自主復制，故不會有腫瘤形成的風險；它們也可以通過過濾滅菌，比細胞本身具有更長的保質期；此外，長期重復給藥EXO 不會引起毒性[20]。到目前為止，已有兩項臨床研究報道MSCs-EXO 用于治療GVHD 和慢性腎病（CKD）患者，且無嚴重不良反應[21-22]。因此，MSCs-EXO 被認為是非常有希望的無細胞治療藥物，潛在地發揮整個細胞的功能的同時，又克服了許多伴隨活細胞治療的常見問題，為哮喘及其他呼吸道疾病的診斷和治療提供了新的契機。

3.2 MSCs-EXO 在哮喘治療中的作用 目前，多數MSCs-EXO 在哮喘治療及改善氣道重塑中的應用尚處于實驗研究階段。MSCs-EXO 在哮喘小鼠模型中通過減少氣道中嗜酸性粒細胞、膠原纖維、肺組織中TGF-β 的產生和胸腺中CD3＋CD4+T 細胞的數量，具有減輕肺炎癥反應和逆轉損傷組織重構的能力[23]，并可以促進Tregs 細胞的增殖，增強免疫抑制能力[24]。EXO 具有免疫調節的作用，可影響多種免疫細胞的表達。Fang 等[25]發現給哮喘小鼠全身靜脈輸注iPSCs 衍生的EXO 后，在抑制炎癥細胞浸潤、氣道高反應性、黏液分泌、下調Th2 細胞因子和2組固有淋巴樣細胞（group 2 innate lymphoid cells，ILC2s）功能方面具有顯著作用，更具體地說，EXO 中包裝的miR146a-5p 已被發現介導上述作用，使ILC2s為主的過敏性氣道損傷恢復活力。Ren 等[26]研究發現，多次較單次、鼻內較靜脈更能提高肺間質巨噬細胞組成性表達IL-10，對OVA 誘導的哮喘小鼠具有重要的保護作用，這為過敏性哮喘提供了一種新的預防策略。

4 MSCs-EXO 治療哮喘的機制

4.1 重塑巨噬細胞極化抑制炎癥反應 巨噬細胞是肺組織中最豐富的免疫細胞（約占所有免疫細胞的70%），在調節氣道炎癥和氣道重塑中發揮重要作用。根據特異性細胞因子和表面標志物[27]的表達，巨噬細胞可分為經典活化型（M1）和選擇性活化型（M2）。M1 巨噬細胞可以分泌大量的炎癥介質[包括腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-1β、IL-6、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）][28]。這些炎癥因子與中性粒細胞浸潤、氣道高反應性（AHR）和氣道重塑[29]有關。M2 巨噬細胞[M2 的生物標志物包括arginase-1（Arg-1）、CD206 和IL-10]產生的抗炎環境能促進組織修復[30]。若M1 型和M2 型巨噬細胞比例平衡被打破，可能會引起長期低程度的炎癥反應。因此，M1 和M2 表型轉換可能是哮喘的一種新的治療途徑。Dong 等[31]研究發現，MSCs-EXO 通過抑制腫瘤壞死因子受體相關因子1（tumor necrosis factor receptor-associated factor 1，TRAF1）表達調節NF-κB 和PI3K/Akt 信號通路，促進巨噬細胞M2 極化，從而抑制炎癥反應，促進肺損傷修復，減輕哮喘后的氣道重構。

4.2 增加Tregs 的比例及功能參與免疫調節Tregs 是有效的免疫調節劑，其異常增殖和功能缺陷在哮喘的發生、發展中起著重要的作用。在一項研究中，評估了骨髓間充質干細胞外泌體（bone marrow mesenchymal stem cells exosomes，BMMSC-EXO）對哮喘患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的免疫調節作用，得到的數據表明，BMMSC-EXO 上調了PBMC 的IL-10 和TGF-β1，從而促進了Tregs 的增殖和免疫抑制能力，對哮喘小鼠模型產生免疫調節作用[24]。Mun 等[32]研究發現，鼻內給藥脂肪間充質干細胞外泌體（adipose tissue-derived stromal cells exosomes，ADSCEXO）通過誘導哮喘小鼠的Tregs 擴增顯著減少過敏性氣道炎癥并改善AHR。因此，ADSC-EXO 可以作為哮喘的調節劑。由此可見，MSCs-EXO 可通過多種途徑，增加Tregs 的比例，從而參加免疫反應，減輕哮喘小鼠的氣道炎癥反應，延緩氣道重塑。

4.3 轉移線粒體調節巨噬細胞氧化磷酸化 研究表明，MSCs-EXO 除了轉運生物活性物質外，還具有轉運線粒體的作用[33-35]。BM-MSCs 將含有線粒體的EXO 轉移至外周T 細胞，并調節哮喘中的T細胞免疫應答[35]。含有線粒體的MSCs-EXO 能促進M2 型巨噬細胞的極化和氧化磷酸化[34]，從而增強其生物能量，表明EXO 在細胞間通訊中發揮新的作用，包括EXO 轉運線粒體和對靶細胞的生物能量學調節。

4.4 內源性miRNA 可減輕氣道重塑 miRNA 是EXO 攜帶的一類重要分子，與哮喘的病理進展密切相關[36]。且EXO 中的miRNA 含量高于其親代細胞。它們主要通過與靶基因3'端非翻譯區不完全配對，在轉錄后水平抑制靶基因的翻譯過程，從而來調控炎癥反應和信號通路。最近有研究表明，BMMSCEXO 來源的miR188 可以通過JARID2/Wnt/βcatenin 軸減弱哮喘小鼠模型中支氣管平滑肌細胞的增殖和肺損傷。另一項研究顯示，BMMSC-EXO來源的miR-221-3p 可以通過抑制FGF2 介導的ERK1/2 信號通路，從而減弱了OVA 誘導哮喘小鼠氣道平滑肌細胞的增殖、遷移和細胞外基質沉積，減輕哮喘進展[37]。此外，EXO 可以顯著降低支氣管平滑肌細胞體外的異常增殖和遷移[38]。Feng 等[39]研究了ADSC-EXO 來源miR-301a-3p 在哮喘小鼠模型中的治療潛力。他們報道EXO 被氣道平滑肌細胞有效內化，其分泌miR301a-3p 通過靶向STAT3 顯著下調炎癥因子、血小板衍生生長因子-BB（PDGFBB），刺激細胞增殖和遷移，增加細胞凋亡，改善氣道重塑。

哮喘氣道損傷的治療一直是肺臟再生醫學的熱點和難點問題，傳統的治療方法和MSCs 細胞療法都存在一定的缺陷。現有的研究結果表明，MSCs-EXO 具有抑制炎癥反應、參與免疫調控、改善氣道上皮重塑、延緩哮喘病情進展等作用，可能是比MSCs細胞療法更為安全和經濟有效的方式。但是到目前為止，由于對所涉及的分子機制了解有限，并且還沒有大型的、隨機的、安慰劑對照的臨床試驗來評估MSCs-EXO 對哮喘的影響。作為一種無細胞替代治療藥物，對MSCs-EXO 的研究尚處于起步階段，如下問題需要解決：（1）哪一種MSCs 是制備EXO的最佳來源。（2）全身（靜脈、腹腔）或局部（氣管內、胸膜內、鼻內）哪種給藥途徑能夠達到最佳治療效果。（3）在給藥頻次上，單次給藥還是多次給藥，哪種更好。（4）哪些成分在MSCs-EXO 的生物學效應中起關鍵作用。（5）提取MSCs-EXO 的金標準動物模型等。因此，未來仍需要開展大量臨床研究，對MSCs-EXO 在哮喘治療中的效果、機制和安全性進行更深入的探討。