宮頸鱗狀細胞癌中SMC4、CTLA4表達情況及其早期診斷價值

高婷婷，王兆林,師增增，李雪峰，梁 立△，王 麗

1.中國人民解放軍空軍軍醫大學唐都醫院婦產科，陜西西安 710038；2.西安醫學院，陜西西安 710077

宮頸癌是全世界范圍內發病率較高的女性惡性腫瘤，發病率高居世界女性惡性腫瘤第2位，僅次于乳腺癌[1]。我國宮頸癌患病人數占全世界患病人數的33%，病死人數占全世界因宮頸癌病死人數的11.30%，嚴重威脅女性的生命健康[2]。宮頸鱗狀細胞癌是宮頸癌的主要發病類型，約占宮頸癌的95%，盡管目前醫學技術飛速發展，但宮頸鱗狀細胞癌的有效篩查及早期診斷情況仍不盡人意[3-4]。染色體結構維持蛋白4(SMC4)是染色體ATP酶超家族成員之一，近年研究發現，SMC4在宮頸癌組織中異常表達，認為SMC4過表達可通過激活NF-κB通路促進宮頸癌的發展[5]。細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA4)是存在于活化T及B淋巴細胞表面的一種跨膜蛋白，可介導T淋巴細胞增殖及分化過程，幫助腫瘤細胞脫離免疫監視，從而參與多種惡性腫瘤的發生及發展[6-7]。本研究觀察分析了宮頸鱗狀細胞癌組織中SMC4、CTLA4表達變化及其早期診斷價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年1月至2017年1月中國人民解放軍空軍軍醫大學唐都醫院(以下簡稱本院)收治的112例早期宮頸鱗狀細胞癌患者為觀察組，其中國際婦產科聯盟(FIGO)宮頸癌分期ⅠB1期69例(61.61%)，ⅡA期43例(38.39%)；有淋巴結轉移42例(37.50%)，無淋巴結轉移70例(62.50%)；腫瘤最大徑<4 cm 62例(55.36%)，腫瘤最大徑≥4 cm 50例(44.64%)；組織分化程度為低分化49例(43.75%)，中高分化63例(56.25%)。(1)納入標準：①所有患者均符合《婦產科學》[8]中宮頸鱗狀細胞癌診斷標準，且經病理檢查確診；②首次診斷，FIGO分期為ⅠA～ⅡB期，既往未進行放化療；③依從性良好，可配合檢查及治療。(2)排除標準：①重要器官存在嚴重功能障礙；②哺乳期或妊娠期女性；③合并宮頸相關疾病；④年齡>70歲。選擇同期140例懷疑宮頸疾病于本院進行病理檢查的女性為對照組，均排除宮頸癌。所有研究對象均簽署知情同意書，本研究經本院醫學倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1臨床資料收集 收集各組受檢者流產史、絕經情況、首次性交年齡、首次生育年齡、孕次、婦科疾病史、家族腫瘤史、飲酒、吸煙、年齡、民族、婚姻狀態等臨床資料。

1.2.2血清指標檢測 采集兩組受檢者清晨空腹靜脈血，3 000 r/min離心10 min，收集血清標本于—40 ℃低溫冰箱中保存待測，避免反復凍融。采用羅氏Cobas 6000化學發光分析儀檢測糖類抗原(CA)125、CA199、癌胚抗原(CEA)、人附睪蛋白-4(HE4)水平。

1.2.3免疫組化法檢測SMC4及CTLA4 取各組受檢者宮頸組織標本，10%甲醛固定后石蠟包埋，制成石蠟切片，厚度為4 μm，恒溫箱烤片30 min，切片抗原修復，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，3%過氧化氫滴加于切片中，室溫下孵育15 min，PBS沖洗3次，山羊血清封閉30 min，滴加SMC4、CTLA4一抗(SMC4一抗購于上海優寧維生物科技股份有限公司，CTLA4一抗購于武漢博歐特生物科技有限公司)，4 ℃恒溫箱中孵育15 h，PBS沖洗3次，滴加辣根過氧化物酶標記的兔抗山羊IgG二抗(購于北京博爾西科技有限公司)室溫孵育20 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色蘇木素復染1 min，1%鹽酸酒精分化，PBS水洗反藍，脫水透明后封膠，顯微鏡下觀察各組宮頸組織著色強度。高倍視野下判斷染色強度及陽性率：不著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。陽性細胞率記分：0分為陽性細胞≤5%，1分為>5%～25%；2分為>25%～50%；3分為>50%～75%；4分為>75%。陰性為兩種積分之和為0～1分，弱陽性為2分，陽性為3～4分，強陽性為5分及以上。0～2分為低表達，3分及以上為高表達。根據SMC4表達評分分為SMC4高表達組(SMC4表達評分≥3分)及SMC4低表達組(SMC4表達評分<3分)，根據CTLA4表達評分分為CTLA4高表達組(CTLA4表達評分≥3分)及CTLA4低表達組(CTLA4表達評分<3分)。

1.2.4隨訪評估 通過電話及復診隨訪所有宮頸鱗狀細胞癌患者，隨訪日期截至2021年1月31日，記錄并比較不同SMC4及CTLA4表達情況患者的生存周期。

2 結 果

2.1兩組各項檢測指標及臨床資料比較 與對照組比較，觀察組宮頸組織SMC4及CTLA4表達評分、CA125、HE4、CA199、CEA水平明顯升高，同時觀察組有流產史、已絕經、首次性交年齡<20歲、首次生育年齡<20歲、孕次>5次、有婦科疾病史患者比例均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。SMC4及CTLA4免疫組化染色結果見圖1、2。

表1 兩組各項檢測指標及臨床資料比較或n(%)]

組別n民族漢族其他婚姻狀態已婚離婚、喪偶流產史無有對照組140120(85.71)20(14.29)124(88.57)16(11.43)80(57.14)60(42.86)觀察組11298(87.50)14(12.50)92(82.14)20(17.86)30(26.79)82(73.21)t/χ20.1702.10023.312P0.6800.147<0.001

組別n絕經是否首次性交年齡(歲)<2020～<25≥25首次生育年齡(歲)<2020～<25≥25對照組14052(37.14)88(62.86)24(17.14)48(34.29)68(48.57)32(22.86)68(48.57)40(28.57)觀察組11270(62.50)42(37.50)46(41.07)36(32.14)30(26.79)56(50.00)40(35.71)16(14.29)t/χ216.01920.50521.242P<0.001<0.001<0.001

續表1 兩組各項檢測指標及臨床資料比較或n(%)]

組別n吸煙是否飲酒是否家族腫瘤史有無對照組14020(14.29)120(85.71)16(11.43)124(88.57)32(22.86)108(77.14)觀察組11214(12.50)98(87.50)16(14.29)96(85.71)20(17.86)92(82.14)t/χ20.1700.4580.950P0.6800.4980.330

注：A為對照組宮頸組織SMC4免疫組化染色圖片；B為觀察組宮頸組織SMC4免疫組化染色圖片。

注：A為對照組宮頸組織CTLA4免疫組化染色圖片；B為觀察組宮頸組織CTLA4免疫組化染色圖片。

2.2影響宮頸鱗狀細胞癌發生的危險因素分析 多因素Logistic回歸分析發現，SMC4高表達、CTLA4高表達、有流產史、已絕經、首次性交年齡<20歲、首次生育年齡<20歲、孕次>5次、有婦科疾病史，以及CA125、HE4、CA199、CEA水平升高均為宮頸鱗狀細胞癌發生的危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 影響宮頸鱗狀細胞癌發生的危險因素分析

續表2 影響宮頸鱗狀細胞癌發生的危險因素分析

2.3不同SMC4、CTLA4表達情況患者生存曲線分析 56例宮頸鱗狀細胞癌患者成功隨訪，平均隨訪時間為34個月(5～60個月)，Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示，SMC4高表達患者(26例)總生存率為61.54%(16/26)，明顯低于SMC4低表達患者(30例)的80.00%(24/30)，差異有統計學意義(P<0.05)。CTLA4高表達患者(28例)的總生存率為60.71%(17/28)，明顯低于CTLA4低表達患者(28例)的82.14%(23/28)，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

注：A為不同SMC4表達情況患者生存曲線；B為不同CTLA4表達情況患者生存曲線。

2.4SMC4、CTLA4診斷宮頸鱗狀細胞癌的價值分析 ROC曲線分析發現，SMC4、CTLA4診斷宮頸鱗狀細胞癌的AUC分別為0.715、0.752，SMC4+CTLA4診斷宮頸鱗狀細胞癌的AUC為0.875，二者聯合診斷宮頸鱗狀細胞癌的AUC明顯大于SMC4、CTLA4單獨檢測(Z=5.714、3.075，P<0.05)。見表3、圖4。

表3 SMC4、CTLA4診斷宮頸鱗狀細胞癌的價值分析

圖4 SMC4、CTLA4診斷宮頸鱗狀細胞癌的ROC曲線

3 討 論

宮頸鱗狀細胞癌是全世界范圍內常見的女性惡性腫瘤，近年統計發現，全世界每年有50萬人確診為宮頸鱗狀細胞癌，其中發展中國家的人數占90%以上[9]。隨著近年生活節奏的加快及生活壓力的增加，宮頸鱗狀細胞癌患病率不斷增加，且呈現年輕化趨勢，成為醫學界關注的焦點。目前，臨床治療宮頸鱗狀細胞癌的主要方式為手術治療，但由于宮頸鱗狀細胞癌早期癥狀不典型，多數患者確診時已處于中晚期，耽誤手術治療的最佳時機，預后情況較差[10-11]，因此，尋找有效篩查及早期診斷宮頸鱗狀細胞癌的方法成為婦科領域關注熱點。

SMC4是近年研究惡性腫瘤的常見因子，可通過調控染色體的聚合及分離過程介導腫瘤細胞的增殖及遷移過程[12-13]。目前研究發現SMC4在乳腺癌、肝癌、胰腺癌、結腸癌等多種惡性腫瘤組織中呈明顯高表達，具有一定致癌性，通過參與腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉移過程促進腫瘤的發展[14]。宿主免疫系統變化影響著腫瘤的發生及發展進程，CTLA4作為一種跨膜蛋白，可通過調節T淋巴細胞的增殖及活化過程抑制機體的免疫應答，促進腫瘤細胞的轉移及侵襲。目前研究發現，CTLA4在膽管癌、乳腺癌及鼻咽癌等多種惡性腫瘤中明顯高表達，且其水平越高，患者預后情況越差[15-16]。近年研究發現，CTLA4在宮頸癌中呈異常表達狀態，可能參與宮頸癌的發生及發展[17]。本研究結果顯示，與對照組比較，觀察組宮頸組織SMC4、CTLA4表達評分明顯升高。這提示SMC4、CTLA4的表達可能與宮頸鱗狀細胞癌的發生及發展存在密切聯系，與林瑤等[18]研究中SMC4作為促癌基因促進宮頸鱗狀細胞癌的發生的結論相近。究其原因，可能與SMC4通過介導染色體形態變化調控腫瘤細胞的增殖過程有關。同時本研究采用多因素Logistic回歸分析發現，SMC4高表達、CTLA4高表達、有流產史、已絕經、首次性交年齡<20歲等因素為影響宮頸鱗狀細胞癌發生的危險因素。Kaplan-Meier生存曲線分析發現，SMC4高表達患者總生存率明顯低于SMC4低表達患者，CTLA4高表達患者總生存率明顯低于CTLA4低表達患者。由此說明，SMC4、CTLA4兩指標的高表達與宮頸鱗狀細胞癌發生及預后情況密切相關。進一步分析SMC4、CTLA4在早期診斷宮頸鱗狀細胞癌中的價值，發現SMC4、CTLA4診斷宮頸鱗狀細胞癌的AUC分別為0.715、0.752，二者聯合診斷宮頸鱗狀細胞癌的AUC為0.875。這提示SMC4、CTLA4在診斷宮頸鱗狀細胞癌方面具有一定價值，其中相較于單一指標，二者聯合診斷價值更高，有助于宮頸鱗狀細胞癌的有效篩查及早期診斷，改善患者預后。

綜上所述，SMC4、CTLA4在宮頸鱗狀細胞癌中表達明顯上調，可能參與宮頸鱗狀細胞癌的發生及發展過程，可作為宮頸鱗狀細胞癌的早期診斷生物學標志物，二者水平升高可能預示著預后不良。