卵母細胞分泌因子在卵巢儲備功能減退患者中的表達及對胚胎發育的影響

程立立，劉少華，劉 珊，許鵬宇，李冬秀，劉松娜，齊麗麗

1.河北醫科大學第三醫院生殖醫學科,河北石家莊 050000；2.邢臺醫學高等專科學校第一附屬醫院婦產科， 河北邢臺 054000；3.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九八〇醫院生殖醫學中心,河北石家莊 050000

目前，晚婚晚育已成為社會常態，特別是我國生育政策放開后，高齡夫婦要求再生育的比例明顯增加，不孕癥的發生率更高[1]。高齡女性卵巢儲備功能下降，需要借助輔助生殖技術實現妊娠，但是其取卵數及可利用胚胎數大大減少，臨床妊娠率較低[2]。如何改善高齡不孕女性助孕治療結局是目前臨床研究的熱點。對于卵巢低儲備功能患者主要以促性腺激素釋放激素拮抗劑 (GnRH-A)方案、微刺激方案及高孕激素狀態下促排卵(PPOS)方案為主要促排卵方案，但哪種方案效果更優仍存在爭議，而且從卵母細胞成熟度方面對這3種方案進行比較，國內外鮮有研究。因此，本研究通過分析卵母細胞分泌因子在卵丘顆粒細胞(CCs)中的表達情況，預測不同的促排卵方案對卵母細胞成熟度及胚胎發育潛能的影響，為高齡不孕女性尋找更有效的促排卵方案，實現獲卵最大化及尋找胚胎移植機會提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019 年1月至2021 年10月于中國人民解放軍聯勤保障部隊第九八〇醫院生殖醫學中心行卵胞漿內單精子顯微注射(ICSI)助孕治療的高齡(本研究定義為年齡≥38歲)DOR患者為研究對象。納入標準：(1)年齡≥38 歲；(2)符合卵巢低反應的標準[3]，①抗苗勒氏管激素(AMH)為0.5～1.1 ng/mL或者促卵泡激素(FSH)/促黃體生成素(LH)>3.6；②雙側卵巢竇卵泡數(AFC)5～7個；③既往有卵巢儲備功能減退(DOR)或卵巢早衰(POF)病史，常規刺激方案獲卵數≤3個。滿足以上3 項中任意2 項即為DOR。排除標準：(1)夫婦雙方或一方存在染色體異常；(2)合并各種內分泌代謝疾病，如甲狀腺功能亢進癥或甲狀腺功能減退癥、糖尿病、高泌乳素血癥、多囊卵巢綜合征等。本研究共納入80例患者425份CCs。

1.2促排卵方法

1.2.1分組 根據促排卵方案，隨機分為PPOS方案組(20 例89份CCs)、GnRH-A方案組(30例165份CCs)及微刺激方案組(30例171份CCs)。另外根據卵母細胞成熟情況，將卵母細胞分為GV期、MⅠ期及MⅡ期，MⅡ期根據受精情況分為正常受精組及異常受精組；正常受精組繼續培養至第3日，根據胚胎情況分為優質胚胎組及非優質胚胎組；非優質卵裂胚繼續培養至第5日或第6日囊胚期，分為優質囊胚組及非優質囊胚組。

1.2.2促排卵方案 微刺激方案：月經第2天或第3天開始給予來曲唑(LE，江蘇恒瑞醫藥集團有限公司)2.5 mg/d或氯米芬(CC) 100 mg/d口服，同時給予注射用尿促性素(HMG，廣州麗珠集團股份有限公司)，起始劑量為75～150 IU/d，5 d后停用LE或CC，根據患者卵泡大小和激素水平來調整促性腺激素(Gn)劑量，當卵泡直徑為12～14 mm或血清LH水平>5 IU/L,皮下注射醋酸西曲瑞克(思則凱，默克雪蘭諾有限公司，瑞士)0.25 mg,每天1次,直至注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)日。

GnRH-A方案：于月經第2天或第3天開始，給予注射用重組人促卵泡素(果納芬，默克雪蘭諾有限公司，瑞士)，起始劑量為150～300 IU/d，根據卵泡大小及激素水平適時調整Gn劑量，當卵泡直徑為12～14 mm，和(或)雌二醇(E2)水平超過400 pg/mL，和(或)LH>5 IU/L時，加用醋酸西曲瑞克(思則凱，默克雪蘭諾有限公司，瑞士)0.25 mg/d，直至注射HCG日。

PPOS方案組：月經第2～3天，B超提示卵泡直徑≤7 mm，開始使用地屈孕酮(達芙通，雅培制藥有限公司，美國)20 mg/d，同時應用HMG(廣州麗珠集團股份有限公司)150～300 IU/d，根據患者激素水平及卵泡發育情況來調整Gn劑量，直至注射HCG日。

當雙側卵巢中直徑≥18 mm的卵泡數是直徑≥14 mm的卵泡數的60%～70%,每個卵泡的平均E2水平為200～300 pg/mL時進行扳機,于扳機后36～38 h進行經陰道B超引導下取卵術。

1.2.3觀察指標 取卵后4～6 h采用機械法剝離單個卵子周圍的CCs，使卵母細胞與單卵丘顆粒細胞群一一對應。觀察GV、MⅠ、MⅡ期卵母細胞中生長分化因子-9(GDF-9)、骨形成蛋白-15(BMP-15)和轉化生長因子-β1(TGF-β1)的相對表達量；所有的成熟卵母細胞均采用ICSI授精，并連續觀察受精、卵裂及囊胚形成情況。2PN為正常受精，其余為異常受精 。本中心優質胚胎的評分標準[4]：卵裂球7～9 個、排列規則、碎片≤20%。Gardner囊胚評分系統標準：≥4AA、4AB、4BA、4BB的囊胚為優質囊胚。

1.3卵母細胞分泌因子檢測方法

1.3.1CCs中RNA提取及反轉錄反應 GDF-9、BMP-15和TGF-β1的mRNA提取方法按照Trizol進行。提取的RNA采用瓊脂糖凝膠電泳判定是否合格，然后按照反轉錄反應試劑盒(普洛麥格生物技術有限公司)說明書進行反轉錄,反應條件如下：70 ℃ 10 min,42 ℃50 min,95 ℃5 min。

1.3.2實時熒光定量聚合酶鏈反應 GDF-9、BMP-15和TGF-β1的mRNA表達量檢測，按照 QuantiFast?SYBR?Green 試劑盒(德國Qiagen Rotor-Gene Q)說明書進行檢測并收集數據：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s,60 ℃退火/延伸30 s,共40個循環。將所得的Ct值按照公式2ΔCt進行計算。

2 結 果

2.13組患者基線資料比較 3組患者年齡、不孕年限及卵巢功能指標等基線資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。GnRH-A方案組采用Gn天數及Gn劑量明顯多于微刺激方案組和PPOS方案組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組患者基線資料比較

組別nbLH(mIU/mL)bE2(pg/mL)采用Gn天數(d)Gn劑量(IU)微刺激方案組304.99±1.1361.77±13.889.55±0.892077.50±153.23PPOS方案組204.62±0.7871.29±17.209.50±1.052061.25±152.06GnRH-A方案組304.64±1.0370.03±18.9010.16±0.91ab2232.50±168.94abP0.4190.1570.024<0.001

2.2總RNA檢測 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA結果顯示，提取的RNA完整性及純度均較高，符合實驗條件，見圖1。

注：1、2泳道為成熟卵母細胞RNA;3、4泳道為未成熟卵母細胞RNA。

2.3聚合酶鏈反應產物凝膠電泳檢測結果 聚合酶鏈反應產物通過電泳檢測驗證可見電泳條帶清晰單一，見圖2。

2.4微刺激方案組中GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相對表達量 在微刺激促排卵方案組中，MⅡ期的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達量明顯高于MⅠ期，差異有統計學意義(P=0.037、P=0.046、P<0.001)； MⅠ期GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達量明顯高于GV期，差異有統計學意義(P=0.046、P<0.001、P=0.035)；正常受精組的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達量明顯高于異常受精組，差異有統計學意義(P=0.001、P=0.012、P=0.048)；優質胚胎組的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達量均明顯高于非優質胚胎組，差異有統計學意義(P=0.007、P=0.015、P=0.003)；優質囊胚組GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達量明顯高于非優質囊胚組，差異有統計學意義 (P=0.048、P=0.040、P=0.037)。見表2。

注：1～5泳道分別為100 bp DNA ladder、TGF-β1、核糖體蛋白L/P(RDL-19)、BMP-15、GDF-9。

表2 微刺激方案組中GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相對表達量

2.5GnRH-A方案組中GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相對表達量 在GnRH-A方案組中，MⅡ期的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達量明顯高于MⅠ期，差異有統計學意義(P=0.029、P=0.025、P=0.049)，MⅠ期GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達量明顯高于GV期，差異有統計學意義(P=0.014、P=0.038、P=0.043)；正常受精組的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達量明顯高于異常受精組，差異有統計學意義(P=0.036、P=0.034、P=0.044)；優質胚胎組的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達量明顯高于非優質胚胎組，差異有統計學意義(P=0.014、P=0.002、P<0.001)；優質囊胚組的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達量明顯高于非優質囊胚組，差異有統計學意義(P=0.029、P=0.049、P=0.045)。見表3。

表3 GnRH-A方案組中GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相對表達量

2.6PPOS方案組中GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相對表達量 在PPOS方案組中，MⅡ期的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達量明顯高于MⅠ期，差異有統計學意義(P=0.016、P=0.049、P=0.023)，MⅠ期的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達量明顯高于GV期，差異有統計學意義(P=0.026、P=0.044、P=0.044)；正常受精組的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達量明顯高于異常受精組，差異有統計學意義(P=0.028、P=0.024、P=0.036)；優質胚胎組的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達量明顯高于非優質胚胎組，差異有統計學意義(P=0.026、P=0.040、P<0.001)；優質囊胚組的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達量明顯高于非優質囊胚組，差異有統計學意義(P=0.016、P=0.037、P=0.039)。見表4。

表4 PPOS方案組中GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相對表達量

2.73組在卵母細胞階段GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相對表達量比較 GnRH-A方案組GDF-9、BMP-15相對表達量明顯高于微刺激方案組、PPOS方案組，差異有統計學意義(P<0.05)；微刺激方案組BMP-15相對表達量明顯低于PPOS方案組，差異有統計學意義(P<0.05)；其余各組間GDF-9、BMP-15、TGF-β1相對表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 3組在卵母細胞階段GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相對表達量比較

3 討 論

DOR是一種以卵巢內可募集的AFC減少和(或)卵母細胞質量下降，導致配子生成功能下降，生育力低下的生殖內分泌疾病[5]。DOR病因眾多，即使經過全面評估，病因仍不明確，主要與遺傳、年齡、自身免疫性疾病、感染性疾病、社會環境及心理等多種因素有關[6]。輔助生殖技術是DOR患者在有限的時間內盡快實現生育的重要輔助治療手段，在生殖醫學領域備受關注。目前,如何更有效地預測胚胎的發育潛能，為DOR患者選擇個體化的促排卵方案，在最短的時間內最大限度增加獲卵數及優質胚胎數是生殖醫學領域迫切需要解決的難題之一。

CCs緊緊包繞在卵母細胞周圍，與卵母細胞關系最為緊密，對卵母細胞的生長、發育、成熟、受精發揮至關重要的作用。CCs和卵母細胞通過縫隙連接進行雙向交換，CCs為卵母細胞成熟及發育提供必需的營養物質，促進卵母細胞成熟、排卵及隨后的胚胎發育，提高卵母細胞質量。同時卵母細胞調控CCs的細胞外基質合成及細胞分化，并積極調節CCs的功能，從而控制復雜的CCs微環境。CCs基因的表達譜因卵母細胞成熟的階段不同而不同。

本研究選取CCs作為研究載體，可以使CCs與卵母細胞一一對應，較壁層顆粒細胞及卵泡液有更高的同源性、特異性及較低的污染率[7-8]，研究結果更加精確。本研究首次對高齡患者的單卵丘顆粒細胞群進行研究，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應來定量檢測卵母細胞分泌因子GDF-9、BMP-15及TGF-β1 的相對表達量。

卵母細胞的發育潛能包括恢復第1次減數分裂；受精后能夠正常卵裂；能夠發育至囊胚期；能足月活產；子代健康[9]。卵母細胞成熟度包含卵母細胞核成熟和細胞質成熟，只有細胞質和細胞核同步成熟，卵母細胞才能成熟，并完成受精及后續的胚胎發育[10]。

本研究對高齡患者的胚胎從卵母細胞到囊胚形成階段進行連續性研究，且能做到和單卵丘顆粒細胞群一一對應進行觀察及檢測，使結果更客觀、更精確，從而為胚胎學醫生選擇優質卵母細胞提供更有價值的參考，更好地預測卵母細胞的發育潛能。

本課題組最近一項研究顯示，在年齡<35歲患者中，卵母細胞分泌因子可作為評價卵母細胞質量、預測卵母細胞發育潛能的客觀指標[11]。但是卵母細胞分泌因子在高齡患者中的相對表達量，以及其對卵母細胞成熟度及其胚胎發育潛能的連續性研究鮮有報道。

本研究結果顯示，在3種促排卵方案中，MⅡ期GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相對表達量高于MⅠ期和GV期；正常受精組的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達量高于異常受精組(P<0.05)；優質胚胎組的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達量高于非優質胚胎組(P<0.05)；優質囊胚組的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達量明顯高于非優質囊胚組(P<0.05)。由此可以看出，上述3 種卵母細胞分泌因子可作為高齡DOR患者評估卵母細胞質量、預測卵母細胞發育潛能的客觀指標。

隨著國家生育政策的實施，尤其是“三孩”政策的放開，高齡生育人群越來越多，DOR患者在生育人群中所占的比例也越來越高，其在輔助生殖過程中，存在Gn用量大，藥物反應差，獲卵少，胚胎質量差等問題[12]。雖然各種促排卵方案均可用于DOR患者，但是對于DOR患者人群而言，需要減少促排卵時間、提高胚胎質量，增加優質胚胎數，在最短的時間實現活產。降調節方案可能導致卵巢過度抑制，致使促排時間長，Gn用量大、花費較高、再次取卵等待時間長等問題。GnRH-A方案和微刺激方案雖然解決了卵巢過度抑制的問題，且卵巢過度刺激綜合征的發生率低，但微刺激方案早發LH峰導致的周期取消率高，新鮮周期移植率低，取卵周期次數增加，同時早期LH升高還可能會影響卵子質量[13],使可利用胚胎數減少，延長妊娠時間；GnRH-A方案可以迅速抑制LH升高的問題，防止卵泡提早黃素化或排卵，降低周期取消率，但DOR患者更易引發突發LH峰，同時伴有E2水平降低，易造成非預期的排卵，使周期取消率增加，需要及時識別突發的LH峰，及早處理。同時，拮抗劑的添加可導致FSH及LH的迅速下降，致使卵泡發育變慢，雌激素水平下降，可能增加Gn用量和采用Gn天數，使周期花費稍微增高。PPOS方案能夠有效預防早發LH峰，降低周期取消率，而且具有Gn周期短、費用低、用藥方便等優點,近年來被廣泛應用于DOR患者。沈秀等[14]將PPOS方案應用于FSH升高的DOR患者，結果發現其能有效抑制LH峰，提高優質胚胎率。最近的研究也表明，PPOS方案較超短方案及微刺激方案，能夠有效抑制早發LH峰，而且卵泡數量、卵子質量、可利用胚胎數及優質胚胎數更多[15-16]。但PPOS方案使卵泡在發育過程中始終處于高孕激素狀態,過早使孕酮作用于子宮內膜，導致胚胎發育和子宮內膜容受性之間的同步中斷,影響卵泡與子宮內膜的同步化,需要全胚冷凍和延遲移植[17-18]。因此，尋找合適的促排卵方案，盡快獲取高質量的卵子和優質胚胎是改善DOR患者輔助生殖臨床結局的關鍵。

本研究分析了高齡不孕患者的卵母細胞分泌因子相對表達量，且在不同促排卵方案之間進行比較，以期找到更適合高齡DOR患者的促排卵方案。本研究按促排卵方案分為微刺激方案組、GnRH-A方案組和PPOS方案組。TGF-β1的相對表達量在不同促排卵方案組中比較，差異無統計學意義(P>0.05)，而GDF-9及BMP-15在不同促排卵方案組中比較，差異有統計學意義(P<0.05)。但GnRH-A方案組采用Gn天數及Gn劑量明顯多于其余兩組(P<0.05)。筆者認為不同的促排卵方案可能影響卵母細胞分泌因子的表達情況，從而影響卵母細胞的成熟度及其后續胚胎的發育潛能，與妊娠結局密切相關。

本研究的不足之處：樣本量較少，分析結果可能存在一定的偏倚，還需要開展大樣本、多中心研究；本研究因大多數患者未進行胚胎移植，因此未進行臨床妊娠結局的比較，在以后的臨床工作中，本課題組會繼續跟蹤觀察這些患者的妊娠情況；目前，這3種方案對于年齡<35歲，卵巢儲備功能正常患者的應用也越來越普遍，因本中心對于卵巢儲備功能正常的患者應用PPOS方案較晚，本研究未與年齡較小、卵巢儲備功能正常的患者進行比較，后續本課題組會進行深入研究。

綜上所述，卵母細胞分泌因子 GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相對表達量可以作為評價卵母細胞成熟度和發育潛能的客觀指標，為高齡患者提高妊娠率提供理論基礎。對于DOR患者，GnRH-A方案可以有效抑制LH峰，降低周期取消率，但Gn用量增加，周期花費較高；微刺激方案采用Gn天數更少、Gn用量低，對卵巢刺激小，但易出現早發LH峰，周期取消率高；PPOS方案能有效抑制LH峰，Gn用量少、花費較少，但因孕激素過早作用于子宮內膜，使卵泡發育和子宮內膜發育不同步，不能行新鮮周期移植，需行全胚冷凍。因此，臨床可根據DOR患者具體情況進行個體化的治療，選擇更合適的方案。