高效液相色譜外標法檢測人血清中拉莫三嗪、卡馬西平及單羥奧卡西平的血藥濃度

王 亮

鄭州大學附屬洛陽中心醫院醫學檢驗科，河南洛陽 471000

癲癇俗稱“羊角風”或“羊癲瘋”，是由于大腦神經元高度同步化異常放電而導致短暫的大腦功能障礙的一種慢性疾病，臨床表現具有發作性、短暫性、重復性和刻板性的特點。由于異常放電的起始部位、波及范圍和傳遞方式的不同，癲癇發作的臨床表現復雜多樣，可表現為發作性運動，以及感覺、自主神經、意識、精神障礙，或兼有之。引起癲癇的發病原因多種多樣，據統計，中國約有900萬癲癇患者，其中500萬至600萬是活動性癲癇患者，該病已成為神經科僅次于頭痛的第2大常見病[1]。拉莫三嗪是新型廣譜抗癲癇藥物，臨床常用于頑固性癲癇的治療?？R西平主要通過降低細胞膜對Na+、Ca2+的通透性，從而使細胞興奮性下降，并增加γ氨基丁酸的抑制功能，阻止腦部異常電位活動向周圍腦組織擴散，能阻止癲癇的發作，是臨床常用的抗癲癇藥物。奧卡西平是卡馬西平的衍生物，在體內迅速轉化為具有生物活性的代謝產物單羥奧卡西平而發揮作用[2-4]。由于上述3種藥物口服吸收慢，藥物代謝易受年齡、合并用藥等因素的影響，導致治療效果不佳或產生不良反應。因此，臨床上需要監測藥物濃度，并根據藥物濃度進行藥物療效的評價，確定個體化給藥方案。本研究建立了簡便的高效液相色譜外標法可同時監測上述3種藥物的血藥濃度，現報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器與藥品、試劑 LC-2010AHT高效液相色譜儀購自日本島津公司。高速冷凍離心機5424R購自美國Eppendorf公司；大容量ST16-40離心機購自美國Thermo Fisher公司；旋渦混合器購自上海醫科大學儀器有限公司；微量加樣器購自美國Eppendorf公司；KQ-300DE數控超聲波發生器購自昆山超聲儀器有限公司；ME104E型分析天平購自梅特勒托利多集團。色譜級甲醇購自天津科密歐化學試劑有限公司。拉莫三嗪、卡馬西平和單羥奧卡西平標準品由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2測定條件及標本處理

1.2.1色譜條件 色譜柱：島津C18色譜柱(4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm)；流動相：甲醇∶水=60∶40；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：240 nm；進樣量：20 μL。

1.2.2溶液配制 稱取卡馬西平、拉莫三嗪對照品各4 mg，加甲醇1 000 mL溶解，得到4 μg/mL的卡馬西平及拉莫三嗪標準液；稱取單羥奧卡西平對照品12 mg，加甲醇1 000 mL得到12 μg/mL的單羥奧卡西平標準液。標準液于4 ℃下保存。

1.2.3標本處理 取血清標本200 μL放置于1.5 mL離心管中，加入600 μL甲醇(漩渦充分混勻后加入)，15 000 r/min離心10 min，取上清液400 μL加入液相小瓶進行分析。

1.3方法學考察

1.3.1專屬性 分別取卡馬西平、拉莫三嗪、單羥奧卡西平標準溶液、服藥患者的血清，按“樣品處理”項操作，測定并記錄色譜圖。

1.3.2標準曲線 取空白血清，加入不同濃度的3種藥品標準溶液，分別配制成含有拉莫三嗪濃度為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL，卡馬西平濃度為0.25、0.50，1.00、2.00、4.00 μg/mL，單羥奧卡西平濃度為0.75、1.50、3.00、6.00、12.00 μg/mL的標準血樣，按“樣品處理”操作，用外標法峰面積定量，測定拉莫三嗪、卡馬西平、單羥奧卡西平線性回歸方程。

1.3.3精密度與回收率 取人空白血清分別加入拉莫三嗪、卡馬西平、單羥奧卡西平標準溶液，分別配制成含拉莫三嗪濃度為0.25、1.00、4.00 μg/mL，卡馬西平濃度為0.25、1.00、4.00 μg/mL，單羥奧卡西平濃度為0.75、3.00、12.00 μg/mL的低、中、高 3個濃度質控樣品。每種濃度平行配制5份，按“樣品處理”操作并測定，由標準曲線求出各樣品的濃度，并計算回收率。以 1 d 內重復5次測定的每種藥物濃度計算日內精密度，另以1周內重復5次測定的每種藥物濃度計算日間精密度。

1.3.4穩定性 取低、中、高濃度拉莫三嗪、卡馬西平、單羥奧卡西平血清質控樣品3份，分別考察提取前室溫放置3 h，提取后4 ℃放置 24 h，—20 ℃反復3次凍融和—20 ℃冰凍放置1個月的穩定性。

1.3.5重復性試驗 本實驗室其他工作人員按擬訂方法繪制標準曲線，得到回歸方程，分別測定5份拉莫三嗪、5份卡馬西平及5份單羥奧卡西平血樣，根據所得結果判定其重復性。

1.3.6最低檢測限確定 以信噪比S/N=3來確定拉莫三嗪、卡馬西平和單羥奧卡西平的最低檢測限。

1.4方法學應用 收集本院神經內科及兒科規律服藥癲癇患者182例，均在血藥濃度達到穩態后于早上服藥前(服藥后12 h)空腹采集血液標本進行檢測。其中單用拉莫三嗪101例，單用卡馬西平56例，單用奧卡西平14例；拉莫三嗪與卡馬西平合用6例，拉莫三嗪與奧卡西平合用5例，卡馬西平與奧卡西平合用0例；拉莫三嗪、卡馬西平及奧卡西平3種藥物合用0例。采用本文建立的方法測定患者血清中拉莫三嗪、卡馬西平及單羥奧卡西平的血藥濃度。列舉兩例長期服用拉莫三嗪的患者加以說明。患者男起始維持劑量為每次100 mg，檢測后維持劑量調整為每次75 mg；患者女起始維持劑量為每次75 mg，檢測后維持劑量調整為每次50 mg。二者均為每日服藥兩次，服藥間隔12 h。兩例患者調藥后維持治療兩周再進行檢測。監測結果與金域公司檢驗結果進行比較。

2 結 果

2.1方法學評價結果

2.1.1專屬性驗證結果 拉莫三嗪、卡馬西平、單羥奧卡西平3種藥物分離效果良好，各色譜峰無重疊，峰形好，且保留時間分別為4.16、7.57、4.59 min。

2.1.2標準曲線結果 拉莫三嗪的直線回歸方程為Y=15 032.4X+22 918.4(r=0.996)，結果表明，拉莫三嗪濃度為0.25～4.00 μg/mL，與峰面積積分值線性關系良好；卡馬西平的直線回歸方程為Y=17 249.7X+52 954.8(r=0.992)，結果表明，卡馬西平濃度為0.25～4.00 μg/mL，與峰面積積分值線性關系良好；單羥奧卡西平的直線回歸方程為Y=6 268.65X+28 631.3(r=0.995)，結果表明，單羥奧卡西平濃度為0.75～12.00 μg/mL，與峰面積積分值線性關系良好。

2.1.3精密度與回收率試驗結果 拉莫三嗪、卡馬西平、單羥奧卡西平的日內和日間精密度均<5%，回收率均為95%～106%，見表1。

表1 拉莫三嗪、卡馬西平和單羥奧卡西平的精密度和回收率試驗結果(n=5)

2.1.4穩定性驗證結果 含有拉莫三嗪、卡馬西平、單羥奧卡西平的血樣在測試過程中和本次儲存條件下較穩定，相對誤差(RE)均在±15%。

2.1.5重復性試驗結果 本實驗室其他工作人員按擬訂方法繪制標準曲線，得到線性回歸方程，并分別檢測5份拉莫三嗪、5份卡馬西平及5份單羥奧卡西平血樣，所得結果與本研究結果相差不大，重復性良好。

2.1.6最低檢測限確定結果 以信噪比S/N=3拉莫三嗪、卡馬西平和單羥奧卡西平的最低檢測限分別為0.25、0.25、0.75 μg/mL。

2.2方法學應用結果 在本院神經內科及兒科收集的規律服藥癲癇患者中，檢測結果大多處于正常血藥濃度或較低血藥濃度，很少出現不良反應(高于正常值)。當測得患者血藥濃度低于或者超出治療藥物濃度時，告知臨床醫生改變用藥策略，使得血藥濃度回歸到藥物濃度治療窗范圍。

下面舉例說明利用本文建立的方法監測血藥濃度的例子。

某癲癇患者，男，16歲，長期服用抗癲癇類藥物拉莫三嗪，2020年10月8日檢測血藥濃度為5.19 μg/mL，降低服藥劑量后2021年1月9日血藥濃度達到4.21 μg/mL，仍然控制在有效治療濃度范圍內，通過本文建立的方法對患者血藥濃度的監測使醫生和患者掌握血藥濃度，使患者在服用較少劑量藥物下仍達到有效治療濃度范圍，控制癲癇發作的同時，減少了不良反應。

某癲癇患者，女，28歲，長期服用癲癇類藥物拉莫三嗪(有效血藥濃度范圍為3～15 μg/mL)，2021年10月8日檢測血藥濃度為9.81 μg/mL(正常高值)，降低服藥劑量后2021年11月11日血藥濃度達到8.43 μg/mL，再次降低服藥劑量后2021年12月16日血藥濃度達到了6.40 μg/mL，仍然控制在有效治療濃度范圍內。見表2。

表2 182例服用拉莫三嗪、卡馬西平及奧卡西平患者血藥濃度監測結果(μg/mL)

3 討 論

目前監測拉莫三嗪、卡馬西平和單羥奧卡西平血藥濃度的方法有高效液相色譜(HPLC)法、熒光偏振免疫(FPIA)法[5]。FPIA法需使用試劑盒，且我國常用的試劑盒為國外進口，有效期短，對于患者不多的醫院，成本相對較高。筆者參考文獻[6-7]建立了簡便、準確的高效液相色譜外標法，可同時測定拉莫三嗪、卡馬西平和單羥奧卡西平的血藥濃度，具有成本低、選擇性好、靈敏度高、精密度高等優點，適合于臨床常規監測這3種藥物的血藥濃度。

臨床應用拉莫三嗪、卡馬西平及奧卡西平治療癲癇患者時常聯合用藥，其血藥濃度與臨床療效相關，對其進行血藥濃度監測對于提高療效和減少不良反應有重要意義，也應在臨床中推薦使用。此方法在本院經歷了兩年多的臨床應用，當測得患者血藥濃度低于或者超出治療藥物濃度時，告知臨床醫生改變用藥策略，使得血藥濃度回歸到藥物濃度治療窗范圍，實踐證明本文提供的方法可行。

本研究方法能夠在短時間內同時測定拉莫三嗪、卡馬西平和單羥奧卡西平的血藥濃度，色譜峰分離度好，無內源性雜質干擾，分析快速、準確、簡便，且樣品處理簡單，適用于臨床血藥濃度的檢測和藥物代謝動力學的研究。本院所收集的癲癇患者雖沒有3種藥物同時服用者，但所建立的方法可大大縮短不同藥物血藥濃度監測中前期沖洗柱子所用時間；此外，本方法為高效液相色譜外標法，檢測準確、方便，且樣本處理過程相對簡便，為日常工作帶來方便。