活血解毒方對HSG 細胞凋亡及炎癥因子表達的影響

張 賽，鄭凌琦，沈正東，徐江喜，張玉婷，劉小平，侯秀娟，朱躍蘭*

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.北京中醫藥大學東方醫院風濕科，北京 100078）

干燥綜合征（Sj?gren's syndrome,SS）是一種侵犯唾液腺、淚腺為主的全身外分泌腺體的慢性炎癥性自身免疫病，以口干、眼干、猖獗齒、反復發生的腮腺炎等為主要臨床表現。本病90%以上病人為女性，多見于30～50歲，我國人群患病率約為0.29%～0.77%[1]。目前認為，SS 的觸發與遺傳、環境因素等相關，而免疫系統的紊亂與T、B 淋巴細胞異常激活、水通道蛋白5（aquaporins 5,AQP5）異常轉運相關[2]。近年來研究發現，外分泌腺細胞的凋亡亦是本病早期病理變化之一，上皮細胞凋亡水平可誘導pSS 樣自身免疫病的發生和抗SSA 和（或）抗SSB 抗體的生成，且可誘導自身免疫性淋巴細胞的浸潤[3]。本研究擬從細胞分子生物學角度，以人頜下腺（human submandibular gland cells,HSG）細胞為研究對象，以TRAIL+INF-γ 誘導凋亡，模擬SS 細胞凋亡微環境，探討活血解毒方對HSG 細胞凋亡及炎癥因子表達的影響，進一步豐富該方治療SS 的生物學依據。

1 材料

1.1 細胞 本實驗所用細胞為HSG 細胞，購自廣州吉妮歐生物科技有限公司，細胞來源歐洲細胞株保存庫（European collection of Authenticated cell cultures,ECACC），貼壁生長，培養條件為90%DMEM 加10%FBS，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養，本實驗選用第4 代細胞。

1.2 藥物 中藥活血解毒方由丹參30 g，玄參20 g，連翹15 g，川芎15 g，雞血藤20 g，炒白芍30 g，生地黃30 g，麥門冬20 g，石斛10 g，南北沙參各15 g，甘草10 g 組成。（以上飲片均購于北京中醫藥大學東方醫院中藥房）；白芍總苷膠囊（寧波立華制藥有限公司生產，國藥準字H20055058）。將上述中藥復方（四劑1 000 g）浸泡1 h，第一煎10 倍水至少煎1 h，第二煎8 倍水至少煎40 min，最終得1 000 mL 藥汁。機器型號：LGJ-10B 冷凍干燥機，軍事醫學科學院實驗儀器研制，北京四環科學儀器廠有限公司制造。冷阱溫度：-45 ℃。真空：1.0。將樣品-20 ℃下預凍2 h，將樣品置于冷凍干燥機中，冷凍干燥48 h 后取出樣品即得。

1.3 試劑與耗材 Annexin V-APC/7-AAD 細胞凋亡檢測試劑盒（中國 江蘇凱基生物技術股份有限公司 KGA1024）；Mouse-anti-FAS（武漢三鷹 60196-1-IG）；Rabbit -anti-FAS-L（Bioss bs-0216R）；Rabbitanti-Cytochrome（武漢三鷹 10993-1-AP）；MaxVision試劑盒(鼠）（中國 福州邁新生物科技有限公司 KIT-5002）；MaxVision 試劑盒(兔）（中國 福州邁新生物科技有限公司 KIT-5005）；DAB Kit（中國 福州邁新生物科技有限公司DAB-1031）；人IL-1β ELISA 檢測試劑盒（Proteintech KE00021）；人TNFα ELISA 檢測試劑盒（Proteintech KE00154）；人IL-6 ELISA 檢測試劑盒（Proteintech KE00139）等。

1.4 儀器 流式細胞儀（美國 Becton-Dickinson FACS Calibur）；立式壓力鍋（中國 上海博訊 YXQLS-50）；超凈工作臺（中國 蘇州凈化 SW-CJ-1FD）；臺式低速離心機（中國上海醫療器械股份有限公司醫療設備廠 80-2）；渦旋振蕩器（中國 海門其林貝爾 XW-80A）；紫外光度儀（日本 SHIMADZU UV-2450）；生物熒光顯微鏡（日本 Olympus BX43）；酶標儀（美國 MD SpectraMax M3）等。

2 方法

2.1 模型構建及分組 將細胞培養分為空白組、誘導組、對照組和小、中、大劑量治療組，并計算各組抑制率，抑制率=[（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100%，對各組進行干預培養時方法如下：空白組：HSG 細胞加培養基；模型組：HSG 細胞加100 ng/mL IFN-γ（20 hrs）加100 ng/mL TRAIL（48hrs）培養基[4]；TGP 組：HSG細胞加100 ng/mL IFN-γ（20 hrs）加100 ng/mL TRAIL（48 hrs）加白芍總苷（5 μg/mL）培養基；小劑量組：HSG 細 胞 加100 ng/mL IFN-γ（20 hrs）加100 ng/mL TRAIL（48 hrs）加HXJDD（1.25 μg/mL）中藥凍干粉培養基；中劑量組：HSG 細胞加100 ng/mL IFN-γ（20 hrs）加100 ng/mL TRAIL（48 hrs）加HXJDD（2.5 μg/mL）中藥凍干粉培養基；大劑量組：HSG 細胞加100 ng/mL IFN-γ（20 hrs）加100 ng/mL TRAIL（48 hrs）加HXJDD（5 μg/mL）中藥凍干粉培養基。

2.2 Annexin-V APC/7-AAD 雙染法檢測細胞凋亡 將對數生長期的細胞消化接種到六孔板中，次日，待細胞貼壁后，根據組別設置加入相應的含藥培養基，同時設立陰性對照組；藥物作用48 h 后，用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集細胞；用PBS 洗滌細胞二次（離心1 000 r/min，5 min）收集5×105細胞；加入500 μL 的Binding Buffer 懸浮細胞；加入5 μL Annexin V-APC 混勻后，加入5 μL 7-AAD，混勻；室溫、避光、反應5～15 min；用流式細胞儀檢測細胞凋亡的情況。

2.3 免疫組化法檢測蛋白表達 每張切片滴加2 滴3%H2O2-甲醇溶液，室溫（15～25 ℃）封閉10 min。封閉后滴加一抗50～100 μL，4℃過夜。滴加羊抗兔/鼠聚合物50 μL，室溫濕盒孵育20 min。PBS 浸洗3 min×3 次；每張片子加2 滴新鮮配制的DAB 溶液后終止顯色。復染后脫水封片，光學顯微鏡下觀察組織細胞中蛋白的表達情況，取3 個高表達區域拍照保存（所有圖片均200×拍攝）。

2.4 ELISA 法檢測蛋白表達 稀釋標準品，分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品50 μL 及待測樣品孔中準確加入50 μL。將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。用封板模封板后置37℃溫育90 min。小心揭掉封板模，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s 后棄去，如此重復5 次，拍干。每孔加入100 μL 生物素化抗體，用封板模封板后置37℃溫育60 min。再次洗滌，每孔加入酶標試劑100 μL 后37℃溫育30 min，洗滌后輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min，終止反應，以450 nm 波長依序測量各孔的吸光度。

3 結果

3.1 造模后各組細胞凋亡情況 見表1。

表1 各組溶液作用于細胞的凋亡情況

3.2 各組HSG 細胞凋亡相關因子蛋白OD 值 免疫組化結果顯示，模型組、TGP 組、中藥組HSG 細胞Fas、FasL、Cyt-C 免疫反應陽性顆粒數目增多，呈淺棕色，而空白組HSG 細胞Fas、FasL、Cyt-C 免疫反應陽性顆粒數目較少，著色淺淡。與空白組相比，模型組Fas、FasL、Cyt-C 蛋白OD 值明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，TGP 組和中藥組Fas、FasL、Cyt-C 蛋白OD 值均明顯降低（P＜0.01）；中藥組與TGP 組相比，Fas、FasL 蛋白OD 值無統計學差異（P＞0.05），Cyt-C 蛋白OD 值明顯降低（P＜0.01）。見表2，圖1～3。

圖1 各組細胞Fas 免疫組化染色（200×）

表2 各組HSG 細胞Fas、FasL、Cyt-C 蛋白OD 值（± s，n =3）

表2 各組HSG 細胞Fas、FasL、Cyt-C 蛋白OD 值（± s，n =3）

注：與空白組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與TGP 組比較，▲▲P ＜0.01

3.3 Elisa 檢測各組細胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度 見表3。

表3 各組HSG 細胞培養上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6 的濃度比較（± s，n =3）

表3 各組HSG 細胞培養上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6 的濃度比較（± s，n =3）

注：與空白組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與TGP 組比較，▲▲P ＜0.01

4 討論

干燥綜合征屬中醫學“燥痹”范疇。多數醫家遵從“燥盛則干”的病機理論，認為本病多因先天稟賦不足或后天調養失當，導致陰津虧虛，清竅失養而發病。朱躍蘭認為燥痹初起即有燥毒存在，津傷日久，燥毒猖獗，邪毒凝集于局部，亦可成血瘀之弊，終成燥瘀毒交雜之勢[5]。朱躍蘭結合多年臨床經驗自擬活血解毒方，用于陰津虧虛、邪毒滯絡證之燥痹的治療，取得了較好的臨床療效。縱觀活血解毒方方藥組成，在潤燥生津解毒的基礎上，更側重丹參、雞血藤、川芎等活血化瘀類中藥，以此通過調節血液流動狀態祛除瘀滯，從而疏其血氣，令其調達，最終達到新物生，腐物消，機能復的目的[6]。

圖2 各組細胞FasL 免疫組化染色（200×）

圖3 各組細胞Cyt-C 免疫組化染色（200×）

Cyt-c 是存在于線粒體膜間隙的第一個被鑒定出來最重要的凋亡促進因子，是呼吸鏈電子傳遞的物質，也是調控細胞凋亡的重要蛋白，當受到凋亡刺激后，線粒體膜的通透性改變，促進Cyt-C 釋放，凋亡隨即發生[7]。研究發現pSS 患者隨著病程的發展，唇腺組織中Cyt-C的表達上調，兩者之間存在相關性，提示Cyt-C 的改變可能是與病程相關的連續進展過程相關[8]。

Fas/Fas L 系統在參與免疫赦免、控制免疫應答及誘導被激活的細胞凋亡、人體自身的耐受機制中均扮演著重要的角色[9]。Fas 和Fas L 主要分布在自然殺傷細胞、T 細胞及生殖細胞、肝、腎、心中，兩者的結合可以對凋亡信號進行傳導，對Fas 所在細胞的整個凋亡過程起誘導作用[10]，外源性的凋亡途徑是通過二者間的相互作用而發生的。

既往研究發現SS 患者中TNF-α 的表達水平顯著高于健康人群，認為TNF-α 在SS 發病發展過程中起著主要作用[11]。TNF-α 是一種多效性細胞因子，能調節細胞生長、分化、誘發炎癥并調控細胞凋亡，能促進B、T 淋巴細胞產生抗體，在炎癥和細胞凋亡中起著至關重要的作用。有研究表明，TNF-α 誘導的基質金屬蛋白酶9 活化會通過破壞腺泡細胞基底膜而導致干燥綜合征患者唾液腺中的腺泡組織破壞[12]。而IL-1β在唇腺上皮細胞也異常表達，揭示了IL-1β 細胞因子也參與了SS 局部唇腺炎的發病過程[13]。IL-1β 可通過激活依賴性和非依賴性途徑，誘導體外培養的新生小鼠細胞發生凋亡；在這一過程中，IL-1β 還可通過精密調控IAPs家族成員的表達，間接促進細胞發生凋亡[14]。而IL-6 的產生原因多是受到了TNF-α、IL-1β 的刺激，其主要免疫學功能是增加中性粒細胞活性，使中性粒細胞趨于集中，增強其他細胞因子的作用效果，在病理狀態下過高的IL-6 濃度會導致免疫性病理損傷，是敏感反映機體炎癥和組織損傷嚴重程度的重要指標。IL-6 的凋亡抑制作用與兩個腺體中Bcl-xL 和Mcl-1 的上調有關。此外，IL-6 處理誘導了人唾液腺上皮細胞系中STAT3 的活化以及Bcl-xL 和Mcl-1 基因表達的上調[15]。

結合文獻研究及前期臨床實驗基礎，5 μg/mL 活血解毒方凍干粉溶液對HSG 細胞凋亡抑制作用最強，對照組選取的是5 μg/mL 濃度的白芍總苷溶液。IHC 法檢測各組蛋白Fas、FasL、Cyt-C OD 值，結果提示中藥組在促進抑制Cyt-C 凋亡蛋白表達方面更優于白芍總苷組。Elisa 檢測檢測細胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6 的濃度，結果提示模型組能夠促進上皮細胞凋亡相關炎性因子的升高，也參與了SS 細胞凋亡的過程。兩治療組均能有效抑制TNF-α、IL-1β、IL-6 炎癥因子的產生，且中藥組在抑制TNF-α、IL-1β 方面更優于白芍總苷組。綜上所述，活血解毒方治療SS 真實有效，且可能是通過有效抑制HSG 細胞凋亡及炎癥因子的表達而實現的。