鬼點燈藥材脂溶性成分及抗氧化活性研究*

趙小超，胡筱希，程英歌，柴 玲，商 勛，廖承譜

（1.江蘇省宿遷市中醫院，江蘇 宿遷 223800；2.廣西中醫藥研究院，廣西 南寧 530022；3.江蘇省宿遷市第一人民醫院，江蘇 宿遷 223800；4.浙江大學金華研究院，浙江 金華 321000）

鬼點燈為紫草科植物柔弱斑種草Bothriospermumtenellum（Hornem.）Fisch.Et Mey.的全草，又名細疊子草、雀靈草、小馬耳朵，國內各地均有分布，國外主要分布在朝鮮、日本、越南、印度、巴基斯坦及俄羅斯中亞等地區，以全草入藥，味微苦、澀，性平，有小毒，歸肺經，具有止咳、止血功效[1］，并明確記載于《民間常用草藥匯編》《中藥大辭典》《中華本草》，應用歷史悠久，療效確切。國內外文獻暫無關于鬼點燈化學成分的報道，對于鬼點燈的現代研究也未見報道，江蘇省揚州市及關中等多地區進行麥田雜草危害調查，結果顯示均有鬼點燈藥材[2］，其本身并無大害且具有一定的藥用價值，卻被視為雜草。本研究中采用氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）儀，以鬼點燈石油醚提取物為研究對象，分析其化學成分，并采用清除自由基試驗研究其抗氧化活性作用。現報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：8860-5977B型氣相色譜-質譜聯用儀（美國Agilent公司）；UV2550型紫外-可見分光光度計（日本Shimadzu公司）；XS205型分析天平（精度為十萬分之一，意大利Mettler Toledo公司）；RE-52A A型旋轉蒸發器、SHB-Ⅲ型真空泵（鄭州長城科工貿易有限公司）；CA-1115A型冷卻水循環裝置（上海愛郎儀器有限公司）。

試藥：1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH，批號為EKKS1297）、2'-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS，批號為EK171020），均購自美國Sigma公司；維生素C（華中藥業股份有限公司，批號為20220108）；95%乙醇、石油醚（60～90℃）、甲醇、無水乙醇等均為國產分析純；水為純凈水。鬼點燈采于江蘇省宿遷市宿豫區曹集鄉田間，經廣西壯族自治區中醫藥研究院黃云峰副研究員鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

2.1.1 試驗條件

色譜條件：色譜柱為DB-WAX UI毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；進樣口溫度為250℃；檢測器溫度為250℃；進樣量為1μL；分流比為10∶1；載氣為氦氣，恒流模式，流速為3.5 mL/min；尾吹氣流速為20 mL/min；空氣流速為450 mL/min；氫氣流速為40 mL/min；程序升溫（初始溫度40℃、保持3 min，以3℃/min的速率升至250℃，保持20 min）。

質譜條件：電離方式為EI源；電子能量為70 eV；離子源溫度為230℃；四極桿溫度為150℃；傳輸線溫度為250℃；質量范圍m/z35～500。

2.1.2 供試品溶液制備

取藥材樣品適量，剪段，以95%乙醇回流提取，10倍量提取3次，以旋轉蒸發儀減壓回收溶劑，收集合并濃縮物得總浸膏。采用系統溶劑法萃取，濃縮，得石油醚提取物（以下簡稱樣品）；取適量，以甲醇超聲（功率100 W，頻率40 kHz；下同）溶解，制成質量濃度為0.1 mg/mL的溶液，經0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液Ⅰ。

2.1.3 圖譜分析

取上述供試品溶液Ⅰ適量，按2.1.1項下試驗條件進樣測定，記錄總離子流色譜圖（見圖1）。通過標準質譜譜庫檢索比對，并采用面積歸一化法計算各組分相對含量。共檢出46個化學成分，鑒定出其中22個主要化學成分（見表1），以脂肪酸、脂肪醇、脂溶性維生素以及香豆素類化學成分為主，其中含量較高的有棕櫚酸、反式-13-十八碳烯酸、生育酚、5，7-二甲氧基香豆素、肌醇。

表1 22個主要化學成分分析結果Tab.1 Analysis results of 22 main chemical constituents

圖1 總離子流色譜圖Fig.1 TIC chromatogram

2.2 抗氧化試驗

2.2.1 DPPH自由基清除實驗

溶液制備：取樣品100 mg，精密稱定，加無水乙醇定容至10 mL，制成供試品溶液Ⅱ，使用前用無水乙醇倍比稀釋成質量濃度分別為1 000，500，250，125，62.5，31.25，15.26，7.63，3.81μg/mL的系列供試品溶液。以維生素C（VC）為陽性對照，同法制成陽性對照品溶液。取DPPH適量，精密稱定，用無水乙醇超聲溶解，制成質量濃度為254μg/mL的標準貯備液。

方法：取系列供試品溶液各適量，分別加樣到96孔板中，每孔20μL，然后每孔平行加入貯備液Ⅰ（標準貯備液以無水乙醇稀釋10倍）180μL，每個質量濃度設置3個平行，同時設立陽性對照及空白對照（70%乙醇200μL）。充分混勻后將96孔板放置在避光環境下反應30 min，在515 nm波長處測定吸光度（A），并計算清除率[3-5］。清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0］×100%，其中A0為標準貯備液和空白對照溶液混勻后測得的吸光度；Ai為標準貯備液和供試品溶液混勻后測得的吸光度；Aj為空白對照溶液和供試品溶液混勻后測得的吸光度（下同）。以供試品溶液質量濃度為橫坐標，清除率為縱坐標作圖。

結果：結果見圖2。脂溶性成分抗氧化活性在3.81～1 000μg/mL質量濃度范圍內呈明顯的劑量依賴性，經SPSS22.0統計學軟件計算得脂溶性成分半數抑制濃度（IC50）為208.69μg/mL，陽性對照的IC50為25.80μg/mL。當質量濃度達到1 000μg/mL時，鬼點燈脂溶性成分清除DPPH自由基能力與陽性對照非常接近，且前者仍呈上升趨勢。結果顯示，雖然在一定質量濃度范圍內，供試品抗氧化活性弱于陽性對照，但供試品溶液質量濃度均處于μg/mL級別，說明鬼點燈脂溶性成分的DPPH自由基清除能力（即抗氧化活性）較強。

圖2 脂溶性成分對DPPH自由基的清除能力Fig.2 Scavenging ability of liposoluble constituents to DPPH free radical

2.2.2 ABTS+自由基清除實驗

溶液制備：分別取ABTS（7 mmol/L）和過硫酸鉀溶液（2.45 mmol/L）各3 mL，混合均勻，室溫避光條件下靜置過夜，制成貯備液Ⅱ。

方法：以70%乙醇將貯備液Ⅱ的A調至0.700±0.005后使用。取2.2.1項下系列供試品溶液各適量，分別加樣到96孔板中，每孔40μL，然后每孔平行加入貯備液Ⅱ160μL，每個質量濃度設置3個平行，同時設立陽性對照（VC）及空白對照（70%乙醇200μL）。重復混合10 s，靜置6 min，在734 nm波長處測定A，并計算清除率。

結果：結果見圖3。脂溶性成分抗氧化活性在3.81～1 000μg/mL質量濃度范圍內呈明顯的劑量依賴性。經計算，脂溶性成分的IC50為146.00μg/mL，陽性對照的IC50為21.20μg/mL。當質量濃度達到1 000μg/mL時，鬼點燈脂溶性成分清除ABTS+自由基能力與陽性對照接近，且前者清除ABTS+自由基能力仍呈上升趨勢。結果顯示，雖然在一定質量濃度范圍內供試品抗氧化活性弱于陽性對照，但供試品溶液質量濃度均處于μg/mL級別，說明鬼點燈脂溶性成分ABTS+自由基清除能力（即抗氧化活性）較強。

圖3 脂溶性成分對ABTS+自由基的清除能力Fig.3 Scavenging ability of liposoluble constituents to ABTS+free radical

3 討論

鬼點燈石油醚提取物經GC-MS法共檢測出48個脂溶性成分，鑒定了22個主要成分，包含脂肪酸、脂肪醇、脂溶性維生素及香豆素等類化合物。抗氧化活性試驗顯示，鬼點燈脂溶性成分具有較強的抗氧化活性，與其化學成分檢測結果前后呼應，印證了檢測結果的可靠性。本研究作為鬼點燈藥材試驗方面的公開報道，首次從該植物石油醚提取物中鑒別出22個化學成分，也證明了其抗氧化活性較強。

天然飽和脂肪酸廣泛存在于自然界植物中，其中棕櫚酸含量較多，研究與應用也較多。有研究表明，棕櫚酸可促進p-65磷酸化上調KLF7表達，引發脂肪細胞炎性反應，抑制細胞GLUT4表達及葡萄糖消耗能力，主要通過激活GPR40/GPR120發揮以上作用[6］；棕櫚酸還具有促進抵抗素-誘導SH-SY5Y人神經母細胞瘤胰島素抵抗和炎性反應、誘導骨骼肌細胞脂質沉積的作用[7-8］，是精神分裂癥急性期主要治療藥物棕櫚酸帕利哌酮的合成底物之一[9］。本研究中鑒定出的生育酚為天然維生素E的重要組成部分，具有較強的抗氧化、抗癌、抗不孕、增強機體免疫功能等作用[10］。肌醇是維持人體生理功能不可缺少的物質，可治療各種維生素缺乏癥、多囊卵巢綜合征、精神及神經性疾病等多種疾病，還具有較強的抗癌作用，是“抗癌之王”肌醇硒酸酯的重要原料[11-12］。國內外研究表明天然抗氧化劑的安全性遠高于合成抗氧化劑[13-14］，本研究中發現鬼點燈藥材石油醚提取物含有大量的天然抗氧化成分，可為天然抗氧劑的制備提供更多物質基礎。

綜上所述，本研究中首次鑒定出鬼點燈藥材脂溶性成分主要含有脂肪酸類、脂肪醇類及維生素類成分；該類成分抗氧化活性較強。