以黃白湯為例探討中藥袋裝湯劑保存期限*

梁烜赫，李飛龍，程 鋼

（安徽醫科大學第一附屬醫院藥劑科·國家中醫藥管理局中藥化學三級實驗室，安徽 合肥 230022）

湯劑是我國獨特的臨床用藥劑型之一，隨著中藥現代化的不斷發展，傳統的煎藥方式（砂鍋煎煮法）正逐漸被先進的煎藥設備取代，越來越多的醫院和代煎機構采用中藥煎藥包裝機代煎湯劑，不僅保證了有效成分的煎出率[1］，還方便了患者，深受醫患雙方的歡迎。《醫療機構中藥煎藥室管理規范》《中藥機器煎藥規范》等規章制度和技術標準對中藥湯劑煎藥環境、飲片、器具及煎煮加水量、火候、時間、次數等作出了更全面、更嚴格的規定。由于中藥方劑煎煮的復雜性，目前患者更傾向于選擇由醫院煎藥室或煎藥機構代煎，以期獲得更好的煎藥質量和臨床療效[2］。但袋裝湯劑不添加任何防腐劑，包裝后是否符合衛生學規定，保質期如何確定，尚無明確標準[3］。微生物污染是中藥湯劑質量不合格的主要潛在原因[4-5］，袋裝湯劑在不同儲存條件下微生物限度考察的相關報道較少[6-8］。在此，以某三甲綜合醫院常用的弱抑菌性中藥湯劑黃白湯為研究對象，采用自動煎藥機煎制灌裝，并根據2020年版《中國藥典（四部）》相關規定建立了微生物限度檢查方法[9］，連續考察4周并分析結果，以期為臨床代煎中藥湯劑的生產、質控和儲存提供一定參考。現報道如下。

1 儀器、試藥與菌株

1.1 儀器

YJD200-GL型十功能自動煎藥機、YB50-250E型中藥湯劑包裝機（北京東華原醫療設備有限責任公司）；BSC-1604ⅡA2型生物安全柜、SW-CJ-100型超潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；SPL-150型生化培養箱、MJL-150型霉菌培養箱（天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司）；YQX-LS-75-SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器、DH64型電熱恒溫干燥箱（上海博訊實業有限公司）；101-3型干燥箱、XW-80A型渦旋混勻儀（上海實驗儀器總廠）。

1.2 培養基與稀釋液

胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA，批號為20171221-00）、胰酪大豆胨液體培養基（批號為20171218-00）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA，批號為20180316-00）、沙氏葡萄糖液體培養基（批號為20171129-00）、麥康凱瓊脂培養基（批號為20180112-00）、麥康凱液體培養基（批號為20171208-00），均購自杭州微生物試劑有限公司；pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（北京路橋技術有限責任公司，批號為20170910）。

1.3 菌種

金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus[CMCC（B）26003］、大腸埃希菌Escherichia coli[CMCC（B）44102］、銅 綠 假 單 胞 菌Pseudomonas aeruginosa[CMCC（F）10104］、枯 草 芽 孢 桿 菌Bacillus subtilis[CMCC（B）63501］、白 色 念 珠 菌Candida albicans[CMCC（F）98001］、黑曲霉Aspergillusniger[CMCC（F）98003］，均由中國醫學菌種保藏中心提供。

2 方法與結果

2.1 袋裝湯劑樣品制備

取15劑黃白湯劑量藥材飲片（黃芪450 g，白芍150 g，甘草45 g），置自動煎藥機煎煮鍋中，加水沒過藥面浸泡30～40 min，按設定程序進行一煎、二煎（均100℃煎煮30 min），合并煎液，程序升溫（最終升至115℃）滅菌10 min，灌封，即得袋裝湯劑約30袋（每袋150 mL）。先用3臺煎藥機（A，B，C）分別制備批號依次為190320-1，190320-2，190320-3（簡寫為A1，B1，C1）的樣品，5 d后再用此3臺煎藥機（經注水煮沸滅菌沖洗后）分別制備批號分別為190325-1，190325-2，190325-3（簡寫為A2，B2，C2）的樣品。

2.2 微生物限度檢查法的適用性試驗

2.2.1 菌液制備

金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌：取4種菌的新鮮培養物，分別接種至胰酪大豆胨液體培養基，30～35℃培養24 h后，再用無菌生理鹽水稀釋成適宜濃度接種量的菌懸液。

白色念珠菌：取該菌新鮮培養物接種至沙氏葡萄糖液體培養基，20～25℃培養3 d后，再用無菌生理鹽水制成適宜濃度接種量的菌懸液。

黑曲霉：取該菌新鮮培養物接種至SDA，20～25℃培養7 d后，加入無菌生理鹽水（含0.05%聚山梨酯80）3～5 mL，洗脫孢子，并制成適宜濃度接種量的孢子懸液。

2.2.2 供試液制備

取B2樣品2袋，每袋100 mL，混勻取10 mL，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，混勻，即得1∶10（V/V）供試液。

2.2.3 驗證試驗

需氧菌總數計數方法適用性試驗：試驗分為試驗組、供試品對照組（供試液+培養基）、菌液對照組（菌液+培養基）。試驗組，取供試液9.9 mL，共5份，分別置滅菌試管中，加2.2.1項下相應試驗菌菌液各0.1 mL，使含菌量≤100 cfu/mL，混勻，從試管中各取1 mL注入平皿（規格為1 mL，下同），每種試驗菌平行制備2個平皿，立即傾注40～45℃的TSA，混勻，待凝，35℃培養3 d，測定試驗組菌落數。同法測定供試品對照組和菌液對照組的菌落數。

霉菌和酵母菌總數計數方法適用性試驗：分組同上。試驗組，取供試液9.9 mL，共2份，分別置滅菌試管中，加2.2.1項下相應試驗菌菌液各0.1mL，使含菌量≤100cfu/mL，混勻，從試管中各取1 mL注入平皿，每種試驗菌平行制備2個平皿，立即傾注40～45℃的SDA，混勻，待凝，25℃培養5 d，測定試驗組菌落數。同法測定供試品對照組和菌液對照組的菌落數。

回收試驗結果計算：回收比=（試驗組菌落數-供試品對照組菌落數）/菌液對照組菌落數。平行試驗3次，結果均符合規定（根據2020年版《中國藥典（四部）》，應介于0.5～2.0），見表1（黑曲霉與白色念珠菌列中，“/”前后數據分別為使用TSA/SDA培養基獲得）。

表1 各驗證菌的回收比結果（n=3）Tab.1 Results of the recovery ratio of each validation bacteria（n=3）

控制菌檢查方法適用性試驗（常規法）：試驗組，取供試液10 mL，加入1 mL大腸埃希菌菌液（含菌量＜100 cfu/mL），接種至胰酪大豆胨液體培養基100 mL；陰性對照組，取0.9%無菌氯化鈉溶液10 mL接種至胰酪大豆胨液體培養基100 mL；陽性對照組，取1 mL大腸埃希菌菌液（含菌量＜100 cfu/mL）接種至胰酪大豆胨液體培養基100 mL；供試品組，取供試液10 mL，接種至胰酪大豆胨液體培養基100 mL。以上各組在35℃培養24 h后，取1 mL培養物，分別加入100 mL麥康凱液體培養基，43℃培養24 h，然后將培養物劃線接種于麥康凱瓊脂培養基平板上，35℃培養3 d，結果僅試驗組及陽性對照組檢出大腸埃希菌。

驗證試驗：結果表明，黃白湯的需氧菌總數計數、霉菌酵母菌總數計數均可采用平皿法（1∶10供試液，1 mL/皿）；控制菌檢查可采用常規法。

2.3 不同儲存條件下的樣品微生物限度考察

樣品儲存：取2.1項下各批次樣品，兩等分，每份15袋，分別儲存于冰箱冷藏室[（5±3）℃］和常溫留樣室[（25±2）℃］。

微生物限度檢查：取以上各批次不同儲存條件的留樣品，平行2份，每周按以上已驗證的方法進行微生物限度檢查，結果見表2至表4。

表2 需氧菌培養結果（cfu/mL，n=2）Tab.2 Culture results of aerobic bacteria（cfu/mL，n=2）

表3 霉菌和酵母菌培養結果（cfu/mL，n=2）Tab.3 Culture results of mold and yeast（cfu/mL，n=2）

表4 控制菌（大腸埃希菌）檢出情況（n=2）Tab.4 Detection of control bacteria（Escherichia coli，n=2）

2.4 不同儲存條件下的黃白湯性狀和p H考察

取以上各批次不同儲存條件的留樣品，每周觀察性狀（溶液顏色與沉淀）變化并測定pH，結果見表5。

表5 性狀觀察及p H測定結果Tab.5 Results of character observation and p H measurement

3 討論

3.1 衛生學標準與考察期限設定

中藥袋裝湯劑作為醫療機構藥學服務的一種延伸產品，應有其相應的產品標準，結合2020年版《中國藥典（四部）》通則1107和代煎湯劑的加工過程，更適用于口服給藥液體制劑的微生物限度標準，即需氧菌總數≤10 cfu/mL，霉菌酵母菌總數≤10 cfu/mL，大腸埃希菌（控制菌）不得檢出；醫師給患者開的處方一般是1～2周用量，極少超過4周，故本試驗中設定時間為4周。

3.2 研究對象選擇

本試驗中選用弱抑菌性的黃白湯作為研究對象，因為弱/非抑菌性的湯劑在制備過程中易被設備、空氣中的細菌污染，儲存過程中細菌繁殖不受干擾，能更真實地反映湯劑被細菌污染的情況和儲存期內菌落數的變化規律。所得微生物考察結果可推及其他組成類似或弱/非抑菌性的中藥湯劑，并可能擴展至有較強抑菌性的湯劑，有較大的涵蓋范圍。

3.3 三批樣品初始菌落數不合格原因

按本試驗中確定的湯劑微生物限度標準，A1，B1，C1樣品需氧菌、霉菌和酵母菌初始菌落數均不合格，菌落數從大到小依次為A1＞B1＞C1。推測原因為，A煎藥機和B煎藥機較常用，煎藥后有藥液殘留在煎藥機儲藥桶與各連接管路中，導致細菌滋生，在本次煎藥前未進行徹底有效的清洗滅菌；3批樣品中，A1及B1為2臺煎藥機共用1臺包裝機經先后順序灌裝封口所得，A1批藥液先通過灌裝管道，起到了清洗作用，故B1批初始菌落數較A1批少；C1批藥液為另一臺不常用煎藥機制備，可能因為機器內部細菌污染少，故初始菌落數最少。煎藥機經清洗滅菌后所得3批樣品的微生物限度檢查初始值均合格，驗證了上述推測。

3.4 結果分析

微生物污染藥品具有隨機性和分布不均勻性[10］，因前3批樣品初始菌落數不合格，難以確定每袋留樣產品的初始染菌數，故在4周內冷藏和常溫儲存的樣品微生物計數結果未呈現明顯規律。但可見，5℃儲存的A1，B1，C1樣品，4周內菌落數一直穩定在同一個數量級范圍內（＜103），其中C1批樣品的需氧菌總數在第3，4周呈下降趨勢，且已不能檢出霉菌和酵母菌。表明冷藏條件不利于微生物的生長繁殖，有利于袋裝湯劑的儲存。而常溫（25℃）保存的A1，B1，C1樣品均曾出現某個時間點菌落數驟增（超過初始值8～10倍）現象，說明常溫條件不利于樣品儲存。A2、B2、C23批樣品初始菌落數均合格，在4周內冷藏和常溫儲存微生物限度的檢查結果也均合格，但冷藏的A2，C2批樣品出現了需氧菌總數增加現象，結合pH測定結果推測原因為，A2，C2樣品的初始pH均較低，低溫可能利于某些適宜酸性環境的微生物生長繁殖，而這些微生物的生長或代謝產物促使藥液pH再降低。但由于藥液初始值合格，冷藏儲存的菌落數始終未超過藥典口服溶液劑規定限度。

隨儲存時間的延長，6批樣品的pH總體呈下降趨勢，下降程度與微生物限度檢查結果呈一定程度正相關，pH下降越多，菌落數檢出越多。B2樣品常溫和冷藏4周內始終未檢出菌落，其pH降幅最小。

新配制樣品溶液顏色為黃色，6批冷藏儲存樣品的顏色均無變化，未出現沉淀；6批常溫儲存的樣品中除B2溶液顏色無變化外，其余5批的顏色均在4周內呈現不同程度加深，A1，B1，C1樣品第2周后出現較多的絮狀物沉淀。推測原因是微生物生長代謝使湯劑質量發生變化[11］。

3.5 反思

因此前未對醫院中藥代煎湯劑的微生物限度進行過考察和分析，對煎藥機清潔消毒的必要性認識不足，在制備前3批樣品前未對煎藥機進行徹底清洗消毒，導致其不符合藥典口服溶液劑微生物限度標準。經分析，染菌的主要原因有兩點，一是煎藥機下部儲藥桶煎藥后未及時清洗及擦干，殘留藥液導致細菌滋生；二是包裝機下部的灌裝軟管和灌封切口在前一天藥液灌裝后未徹底洗凈并消毒，管道內殘留藥液導致細菌滋生致使第二天灌裝的湯劑染菌[12-13］。隨后做了煎藥機清洗驗證試驗，結合文獻[14-15］制訂了煎藥機標準清潔規程，包括每天煎藥完成后徹底清理設備，對煎藥機進行刷鍋、煮水、排液（清理管道）和外部清理；對包裝機內壁進行清理，管道內外沖刷，將灌裝口的藥漬內外清理干凈。待清理完成后，打水袋，直至澄清。此外，還應重視影響微生物限度的其他因素，如人員衛生、物料衛生、煎藥室環境衛生及空氣消毒等[16］，通過管理制度化、操作標準化來保證湯劑的質量。

袋裝湯劑的染菌問題可能是各家醫院及代煎機構普遍存在的共性問題，特別是煎藥頻次不高的代煎機構，由于機器閑置，不連續運行，煎藥染菌概率更大。本研究中的前3批樣品染菌現象對于缺少微生物限度檢驗條件的煎藥機構有一定參考價值。

本研究也存在一定不足，如選方較單一，僅考察了弱/非抑菌性中藥湯劑的保存期，以后還將繼續考察動物類、蜜炙類、含油質種子類等易染菌中藥湯劑的衛生學有效期，以補充完善代煎湯劑的儲存期管理；另外，在湯劑穩定性的考察中，還應加入有效成分/指標性成分的含量測定，使儲存期的確定更科學、更合理。

3.6 小結

綜上所述，本試驗中成功建立了黃白湯的微生物限度檢查方法，并根據4周的考察結果暫定了代煎中藥湯劑的儲存條件和保存期限。對于菌落初始值合格的袋裝湯劑，常溫和冷藏儲存均可保證4周內衛生學合格，冷藏更有利于維持湯劑的初始性狀；對于菌落初始值不合格的袋裝湯劑，冷藏儲存明顯優于常溫儲存，細菌生長緩慢，不易快速繁殖，可保證袋裝湯劑質量。鑒于目前大多數醫院和機構代煎中藥湯劑并未開展微生物質控，煎藥機的清洗效果不能有效驗證，因而無法知曉袋裝湯劑衛生學是否合格及被細菌污染的程度，建議袋裝湯劑的儲存方式以冷藏為主，時間不宜超過4周。