MUC5AC、TIMP-1在毛細(xì)支氣管炎患兒血清中表達(dá)及與喘息發(fā)作的相關(guān)性探究

鄭碩，閆文豪

毛細(xì)支氣管炎是急性下呼吸道感染性疾病且在臨床較為常見，小兒群體是此病的易感群體，多發(fā)于冬季，其病變部位主要在肺部的細(xì)小支氣管，臨床常見癥狀多表現(xiàn)為呼吸急促、呼氣性喘鳴，其中少數(shù)患者存在喘息反復(fù)性發(fā)作的現(xiàn)象，若未得到積極治療甚至惡化轉(zhuǎn)變?yōu)橄?、呼吸衰竭，危及患兒生命安全[1]。近年來，多項(xiàng)研究結(jié)果表明[2]，毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病速度較快，故早期診斷此病有助于患兒盡早接受積極治療、改善預(yù)后。黏蛋白5AC(MUC5AC)具有評(píng)估氣道上皮黏液分泌的功能，是黏蛋白家族主要成員之一；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)是基質(zhì)金屬蛋白酶的內(nèi)源性天然抑制因子，對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性具有很好的抑制作用，其中屬基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)活性最強(qiáng)且參與氣道炎癥損傷和氣道重塑的鏈接轉(zhuǎn)換[3-5]。本研究旨在檢測該疾病患者血清中MUC5AC、TIMP-1表達(dá)，對(duì)比兩者在毛細(xì)支氣管炎患兒血清中表達(dá)變化、在發(fā)病機(jī)制中的作用及與喘息次數(shù)的相關(guān)性，以期為臨床小兒毛細(xì)支氣管炎的治療提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性選取2020年2月至2021年3月在方城縣婦幼保健院內(nèi)兒科就診的毛細(xì)支氣管炎患兒78例作為研究組研究對(duì)象，研究組按病情嚴(yán)重程度被分為輕癥45例，重癥33例；男37例，女41例；年齡3個(gè)月～2歲，出生時(shí)母親年齡23～36歲，呼吸疾病史：有45例，無33例；病程3～12 d；另外同期選取78例在方城縣婦幼保健院內(nèi)兒科進(jìn)行健康體檢的健康兒童作為對(duì)照組研究對(duì)象，年齡4個(gè)月～2歲，出生時(shí)母親年齡25～34歲，兩組基線資料對(duì)比(P＞0.05)，見表1.上述研究對(duì)象家屬對(duì)本次研究均知情、簽署同意書，方城縣婦幼保健院倫理委員會(huì)已批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：(2020)倫審第(26)號(hào)。

表1 兩組基線資料比較[n，(±s)]

女43 41平均年齡/歲 1.29±0.14 1.25±0.16 0.099 1.662出生時(shí)母親平均年齡/歲27.52±2.69 27.56±2.62 0.094 0.925農(nóng)村 21 24剖宮產(chǎn) 14 17性別男35 37 0.103 0.748居住環(huán)境城鎮(zhèn) 57 54 0.281 0.596分娩方式自然分娩 64 61 0.362 0.547項(xiàng)目 對(duì)照組 研究組 統(tǒng)計(jì)值 P值

1.2 選取標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》[6]中毛細(xì)支氣管炎診斷標(biāo)準(zhǔn)且經(jīng)臨床查體、影像學(xué)檢查確診；存在顯著的喘憋和咳嗽癥狀；家屬均知情且簽署承諾書。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝腎功能異常、存在自身免疫性疾?。蝗朐呵?個(gè)月接受過免疫抑制劑、抗血小板等藥物治療，影響研究結(jié)果；肺部發(fā)育不良引起咳嗽；先天氣道性疾病導(dǎo)致高反應(yīng)咳喘；合并哮喘等其他呼吸系統(tǒng)疾病。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 標(biāo)本采集 入組后采集清晨空腹靜脈血5 mL，室溫環(huán)境靜置2 h，3 000 r/min、r＝15 cm離心15 min，-80℃冰箱，保存待用。

1.3.2 MUC5AC檢測 采用逆轉(zhuǎn)錄- 聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測兩組研究對(duì)象血清MUC5AC表達(dá)，實(shí)驗(yàn)步驟：將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件：25 ℃、50 ℃、85 ℃(10 min、45 min、5 min)。cDNA 進(jìn) 行 擴(kuò) 增，引 物 序 列：MUC5AC，F(xiàn)：5’-CGGGTACCTGAG GGACGC CTTGGCTC-3’，R：5’-CCG CTCGAGTGTGTGGACGGCGGGGAAGA-3’；以U6 為 內(nèi) 參，F(xiàn)：5’-GGTTAGAAGTCATACG-3’，R：5’-TGTCATGAATGATCC-3’。反應(yīng)體系為：10 μL BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix(2×)，2 μL cDNA模板，1 μL上下游引物和6 μL H2O。產(chǎn)物擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃、變性均5 min，退火95 ℃、延伸72 ℃分別15 s、30 s，共40個(gè)循環(huán)，MUC5AC相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt計(jì)算。

1.3.3 TIMP-l 檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELIEA)檢測血清TIMP-1水平，實(shí)驗(yàn)步驟：將冰箱中血清標(biāo)本取出放置室溫30 s，備置標(biāo)準(zhǔn)血清及溶液，300 μL洗板液洗板對(duì)其進(jìn)行30 s沖洗，微孔拍干后依次加入檢測緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)液、樣本、檢測抗體均50 μL，封板，震蕩，室溫(37 ℃)孵育2 h，洗板，100 μL的酶標(biāo)記物導(dǎo)入檢測孔，封板，震蕩，放置室溫內(nèi)45 min，洗板，將100 μL底物液加入微孔，30 min避光孵育、加入100 μL終止液、震蕩，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測吸光值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0處理數(shù)據(jù)。用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，符合則計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)進(jìn)行描述，組間兩兩比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，多組間行F值數(shù)據(jù)計(jì)算，計(jì)數(shù)資料以率[n(%)]表示，Pearson相關(guān)性分析MUC5AC、TIMP-1與毛細(xì)支氣管炎的相關(guān)性，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MUC5AC、TIMP-1在對(duì)照組、研究組血清中比較 相比對(duì)照組，研究組血清中MUC5AC、TIMP-1較高，以研究組重癥最為顯著表現(xiàn)為MUC5AC(3.85±0.43)、TIMP-1(179.23±18.54)ng/mL，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝93.240、24.135，P均＜0.05)。見表2。

表2 MUC5AC、TIMP-1在對(duì)照組、研究組血清中比較(±s)

表2 MUC5AC、TIMP-1在對(duì)照組、研究組血清中比較(±s)

注：MUC5AC＝黏蛋白5AC，TIMP-1＝基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1；下同。

組別 例數(shù) MUC5AC TIMP-1/(ng·mL-1)對(duì)照組 78 0.72±0.08 128.46±13.57重癥 33 3.85±0.43 179.23±18.54 F值 93.240 24.135 P值 0.001 0.001研究組輕癥78 45 2.16±0.24 146.82±15.03

2.2 研究組MUC5AC、TIMP-1與喘息發(fā)作的相關(guān)性 研究組MUC5AC、TIMP-1與喘息發(fā)作呈正相關(guān)，即喘息次數(shù)越多，MUC5AC(4.23±0.46)、TIMP-1(182.46±18.27)ng/mL越高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝16.570、7.510，P均＜0.05)，見表3。

表3 研究組MUC5AC、TIMP-1與喘息發(fā)作的相關(guān)性(±s)

表3 研究組MUC5AC、TIMP-1與喘息發(fā)作的相關(guān)性(±s)

項(xiàng)目 例數(shù) MUC5AC TIMP-l/(ng·mL-1)喘息＜3次 45≥3次 33 2.87±0.26 153.79±15.38喘息4.23±0.46 182.46±18.27 t值 16.570 7.510 P值 0.001 0.001

2.3 MUC5AC、TIMP-1 之間的相關(guān)性分析 以MUC5AC、TIMP-1 進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，MUC5AC、TIMP-1 正 相 關(guān)(r＝0.468、P＝0.001)，見圖1。

圖1 MUC5AC、TIMP-1之間相關(guān)性分析

2.4 毛細(xì)支氣管炎發(fā)生影響因素的多元Logistic回歸分析 毛細(xì)支氣管炎為因變量(未發(fā)生＝0，發(fā)生＝1)，MUC5AC、TIMP-1為自變量，賦值升高設(shè)為1，正常設(shè)為0，納入二分類多因素Logistic回歸模型分析，結(jié)果顯示，MUC5AC、TIMP-1為影響毛細(xì)支氣管炎發(fā)生的危險(xiǎn)因素，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表4。

表4 毛細(xì)支氣管炎發(fā)生影響因素的多元Logistic回歸分析

3 討論

研究表明[7-8]，小兒支氣管炎的發(fā)生發(fā)展與炎癥因子和黏液分泌增加密切相關(guān)，患兒多出現(xiàn)一系列呼吸癥狀，如鼻炎、呼吸急促、呼吸做功增加等，且與患兒后期是否發(fā)生復(fù)發(fā)性喘息和哮喘等存在一定關(guān)聯(lián)。毛細(xì)支氣管炎目前臨床認(rèn)為此病是多種因素共同作用的結(jié)果，其中過敏體質(zhì)、家族哮喘史、長期吸入二手煙等均是此病的誘發(fā)因素，目前臨床上暫無早期診斷后發(fā)生反復(fù)喘息的標(biāo)志性指標(biāo)[9]。

黏蛋白具有濕潤吸入氣體、預(yù)防支氣管及肺泡上皮干燥的功效，對(duì)呼吸道具有較好的保護(hù)作用，可防止和避免有毒氣體或微生物的入侵[10-11]。呼吸道黏液的重要組成部分為黏蛋白，而MUC5AC是一種氣道黏液中重要的黏蛋白，且經(jīng)臨床研究證實(shí)[12-14]，其水平變化在慢性鼻- 鼻竇炎、呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎等多種肺部疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，且備受廣大醫(yī)者的關(guān)注。本文研究數(shù)據(jù)得出，MUC5AC在毛細(xì)支氣管炎患兒血清中呈異常高表達(dá)且其表達(dá)隨喘息次數(shù)增加而升高，MUC5AC的作用機(jī)制包括MUC5AC表達(dá)抑制劑叉頭轉(zhuǎn)錄因子A2(FoxA2)、白細(xì)胞介素-13(IL-13)誘發(fā)黏液化生和MUC5AC表達(dá)、表皮生長因子受體誘導(dǎo)MUC5AC表達(dá)，在支氣管炎發(fā)病過程中，炎癥聯(lián)級(jí)反應(yīng)上調(diào)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子6磷酸化并抑制FoxA2 表達(dá)，在一定程度上可促進(jìn)MUC5AC表達(dá)，誘導(dǎo)黏液高分泌，由此佐證在小兒毛細(xì)支氣管炎發(fā)生及病情發(fā)展中MUC5AC起著重要的調(diào)節(jié)作用；此外，毛細(xì)支氣管對(duì)哮喘的發(fā)病具有很大的影響，MUC5AC高表達(dá)意味著氣道黏液高分泌，其水平升高伴隨著喘息次數(shù)增加，可預(yù)測喘息發(fā)作，亦可為哮喘早期防止提供依據(jù)。

上皮下纖維化、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積、基底膜增厚等均為臨床氣道重塑的常見病理特征，可造成持續(xù)性的氣道高反應(yīng)和不可逆的氣流阻塞，在呼吸道重構(gòu)過程中TIMP-1是一個(gè)重要因子，若其表達(dá)水平異常升高則提示可能出現(xiàn)哮喘氣道重塑的標(biāo)志[15-16]。TIMP-1對(duì)成纖維細(xì)胞增生和膠原的合成以及上皮細(xì)胞增殖或纖維化具有促進(jìn)作用，還具有細(xì)胞生長因子的作用，在氣道重塑的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[17]。TIMP-1和金屬基質(zhì)蛋白-9(MMP-9)在機(jī)體健康的狀態(tài)下水平處于相對(duì)平衡狀態(tài)，但在支氣管疾病發(fā)生發(fā)展過程中，因TIMP-1對(duì)MMP-9具有生理抑制性，在支氣管疾病發(fā)生時(shí)，TIMP-1水平隨MMP-9水平的升高而升高，進(jìn)而加重ECM在氣道內(nèi)沉積，最終導(dǎo)致氣道重塑[18]。本文數(shù)據(jù)分析得出，TIMP-1在毛細(xì)支氣管炎患兒血清中表達(dá)異常升高且喘息次數(shù)越多、TIMP-1表達(dá)越高，其作用機(jī)制可能為高表達(dá)TIMP-1促進(jìn)MMP-9的活性增加，進(jìn)而破壞氣道和肺部的細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜在氣道和肺重建中起左右，破壞呼吸系統(tǒng)細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，TIMP-1與喘息密切相關(guān)，是喘息氣道重塑的重要標(biāo)識(shí)因子。據(jù)既往研究結(jié)果顯示[19-21]，毛細(xì)支氣管炎患兒喘息多次復(fù)發(fā)的可能率高達(dá)85%，日后有可能發(fā)展為支氣管哮喘。在本文研究中，MUC5AC、TIMP-1表達(dá)升高與喘息次數(shù)密切相關(guān)，可作為毛細(xì)支氣管炎反復(fù)喘息的預(yù)測指標(biāo)仍值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本文研究結(jié)果顯示，MUC5AC、TIMP-1在毛細(xì)支氣管炎患兒血清中呈異常高表達(dá)，MUC5AC、TIMP-1是毛細(xì)支氣管發(fā)生的影響因素，且其水平升高、喘息次數(shù)越多，兩者水平與喘息次數(shù)呈正相關(guān)。但本文研究仍存在不足之處，如樣本量小、研究對(duì)象單一、病例來源受地域限制，故在今后研究中需增加樣本量、納入多中心研究對(duì)象并擴(kuò)大病例來源范圍，以證實(shí)本文研究的準(zhǔn)確性。