AQP1在黃芩苷調(diào)控肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移、凋亡中的作用及其分子機(jī)制

韋小白，沈瑩，陳靜，田偉平

上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院腫瘤科，上海 200040

肺癌是常見的惡性腫瘤，根據(jù)組織學(xué)類型可分為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（SCLC）。NSCLC占肺癌的80%～85%，其中約40%為腺癌，25%～30%為鱗狀細(xì)胞癌，10%～15%為大細(xì)胞癌［1］。黃芩苷是一種重要的類黃酮化合物，從黃芩中草藥中分離出來，有抗氧化、抗炎、抗感染和抗腫瘤作用［2］。研究表明，黃芩苷能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡和周期阻滯，抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［3］。水通道蛋白家族1（APQ1）是具有高選擇性的水膜通道蛋白之一，與生物體內(nèi)水的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及水平衡的調(diào)節(jié)密切相關(guān)［4］。有研究表明，敲除AQP1基因，相關(guān)腫瘤組織的微血管生成、細(xì)胞的生長均受到明顯抑制［5］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，人肺腺癌細(xì)胞LTEP-A2上AQP1高表達(dá)，使用siRNA基因干擾下調(diào)AQP1表達(dá)后，LTEP-A2細(xì)胞的增殖、遷移能力顯著下降，細(xì)胞凋亡升高；同時(shí)，黃芩苷可降低LTEP-A2細(xì)胞增殖、遷移能力，誘導(dǎo)LTEP-A2細(xì)胞凋亡，然而其機(jī)制仍不清楚。磷酸肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路是一條與增殖、分化和凋亡相關(guān)的經(jīng)典信號通路，Akt途徑由PI3K的活化啟動，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、胰島素樣生長因子（IGF）、蘇氨酸激酶（p-Akt）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）等相關(guān)蛋白均參與PI3K/Akt信號傳導(dǎo)過程。2020年1月—2021年6月，本研究進(jìn)一步探討就黃芩苷是否通過抑制AQP1從而對肺腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡起到影響，以及該影響是否與PI3K/Akt信號通路有關(guān)，以期為肺腺癌的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人肺腺癌細(xì)胞株LTEP-A2購自上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。黃芩苷購自美國sigma合同（貨號：572667，規(guī)格1 g），AQP1小干擾siRNA及AQP1過表達(dá)載體購自武漢ASPEN生物有限公司，DMEM 培養(yǎng)基購于美國Gibco BRL公司，胎牛血清購自杭州天杭生物科技有限公司，LightShift?Chemiluminescent EMSA Kit試劑購自美國Thermo Scientific公司， VEGF、IGF、p-Akt抗體購自英國Abcam公司，mTOR、HIF-1α購自美國CST公司，PI3Kα抑制劑LY294002、磷酸化PI3Kα（p-PI3Kα）抑制劑wortmannin均購自美國Promega公司，PI3K、P-Akt兔抗人一抗購自長沙嘉美生物公司，β-actin一抗購自美國Santa Cruz公司；山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）購自碧云天生物技術(shù)有限公司，二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒購自武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司，酶標(biāo)檢測儀購自中國德科公司，流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，PCR儀購自中國杭州博日科技公司，熒光定量PCR儀購自美國Life technologies公司。

1.2 黃芩苷對AQP1表達(dá)及LTEP-A2細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的影響觀察

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 LTEP-A2細(xì)胞貼壁生長于含有10%胎牛血清、1.2 mg/mL NaHCO3，100 U/mL雙抗（青霉素、鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基中，常規(guī)置于含5% CO2的37 ℃飽和濕度的恒溫密閉培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞生長情況，每2～3 d換液1次，4～5 d后用0.25%胰酶消化傳代。將處于對數(shù)生長期的LTEP-A2細(xì)胞分為對照組及黃芩苷組，對照組正常培養(yǎng)細(xì)胞；黃芩苷組采用濃度200 μmol/L的黃芩苷處理LTEP-A2細(xì)胞48 h。

1.2.2 細(xì)胞AQP1表達(dá)檢測 采用qRT-PCR法。采用Trizol試劑提取各組總RNA，PrimeScript?RT reagent Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，SYBR Primescript RT-PcR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR，嚴(yán)格按照操作說明書操作。引物序列：AQP1正向引物5'-GTGCTATGCGTGCTGGCTAC-3'，反 向 引 物 5'-AAGGACCGAGCAGGGTTAATC-3'；GAPDH正向引物 5'-CATCATCCCTGCCTCTACTGG-3'，反 向 引 物 5'-GTGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3'。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算AQP1相對表達(dá)量。

1.2.3 細(xì)胞增殖情況觀察 取各組LTEP-A2細(xì)胞，以1×104/孔接種于96孔板，置于5% CO2培養(yǎng)箱中在37 ℃下培養(yǎng)24 h。每孔中加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h；應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm時(shí)的光密度值（OD），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率（IR）。IR =（對照孔OD-實(shí)驗(yàn)孔OD）/（對照孔OD-空白孔OD）×100%。

1.2.4 細(xì)胞遷移能力觀察 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞鋪板前，先用marker筆在6孔板的背面均勻畫平行直線，0.5～1.0 cm一道，橫穿過孔，每孔5條。取各組細(xì)胞，每孔加入2 mL含約5×105個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基。待細(xì)胞鋪滿孔底后用槍頭垂直于marker筆的橫線劃掉細(xì)胞。PBS輕輕漂洗掉劃下的細(xì)胞，加入培養(yǎng)基，顯微鏡下拍照，記為0 h。拍照后將培養(yǎng)板放入37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出拍照，計(jì)算細(xì)胞遷移距離。

1.2.5 細(xì)胞凋亡情況觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。用不含EDTA的0.25%胰酶消化各組細(xì)胞，終止消化后離心，去上清，加PBS重懸；再次用PBS將細(xì)胞潤洗2次，1 200 r/min 離心5 min，嚴(yán)格按照AnnexinVAPC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作說明書操作，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 過/降表達(dá)的AQP1對LTEP-A2細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的影響觀察 將處于對數(shù)生長期的LTEPA2細(xì)胞分為對照組、AQP1降表達(dá)組、AQP1過表達(dá)組，對照組不做處理正常培養(yǎng)，AQP1降表達(dá)組、AQP1過表達(dá)組分別轉(zhuǎn)染AQP1小干擾siRNA及AQP1過表達(dá)載體48 h。按照“1.2.2”采用qRT-PCR法方法檢測細(xì)胞AQP1表達(dá)，結(jié)果顯示，對照組、AQP1降表達(dá)組、AQP1過表達(dá)組AQP1表達(dá)分別為1.00 ± 0.05、0.46 ± 0.15、1.31 ± 0.07，細(xì)胞AQP1表達(dá)AQP1過表達(dá)組＞對照組＞AQP1降表達(dá)組，提示轉(zhuǎn)染成功。按照“1.2.3”的方法觀察細(xì)胞增殖情況，按照“1.2.4”的方法觀察細(xì)胞遷移能力，按照“1.2.5”的方法觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.4 黃芩苷下調(diào)AQP1的分子機(jī)制觀察

1.4.1 細(xì)胞分組及處理 將轉(zhuǎn)染AQP1過表達(dá)載體的AQP1過表達(dá)LTEP-A2細(xì)胞分為AQP1過表達(dá)組、AQP1過表達(dá)+黃芩苷組、AQP1過表達(dá)+LY294002組、AQP1過表達(dá)+wortmannin組，AQP1過表達(dá)組不做處理正常培養(yǎng)，另外各組分別采用濃度200 μmol/L的黃芩苷、40 μmol/L的 PI3Kα抑制劑LY294002、40 μmol/L的p-PI3Kα抑制劑wortmannin處理48 h。

1.4.2 黃芩苷調(diào)控AQP1對PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響觀察 采用Western blotting法。取處理后的各組細(xì)胞，移除細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗3遍，加入磷酸化蛋白酶抑制劑，將細(xì)胞樣品移至1.5 mL離心管中離心5 min取上清，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度后保存于-20 ℃?zhèn)溆谩Ｋ″?00 ℃變性，采用SDS-PAGE凝膠試劑盒配制10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后350 mA穩(wěn)流轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，TBST洗滌5 min×3次；置入塑料袋，加 1∶1 000濃度 VEGF、IGF、mTOR、p-Akt、HIF-1α及GAPDH一抗，室溫溫育2 h，TBST洗滌10 min×3次后加1∶1 000相應(yīng)二抗，室溫溫育1 h后TBST洗滌10 min×3次，ECL室溫反應(yīng)5 min，X線片曝光。X線片結(jié)果用Syngene凝膠成像儀掃描，以GAPDH作為內(nèi)源性對照，以目的條帶與對照條帶灰度比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)分析正態(tài)性，符合正態(tài)分布的資料以±s表示，兩組間比較行t檢驗(yàn)，多組間比較行單因素方差分析，組間兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷對LTEP-A2細(xì)胞AQP1表達(dá)的影響對照組、黃芩苷組AQP1分別為1.00 ± 0.05、0.75 ±0.07，黃芩苷組AQP1低于對照組（P＜0.05）。

2.2 黃芩苷對LTEP-A2細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的影響 對照組、黃芩苷組IR分別為0.35% ± 0.14%、2.34% ± 0.37%，細(xì)胞遷移距離分別為（0.705 ±0.029）、（0.300 ± 0.022）μm，細(xì)胞凋亡率分別為4.02% ± 0.34%、20.66% ± 1.37%，黃芩苷組IR低于對照組，細(xì)胞遷移距離、細(xì)胞凋亡率高于對照組（P均＜0.05）。

2.3 過/降表達(dá)的AQP1對LTEP-A2細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的影響 對照組、AQP1降表達(dá)組、AQP1過表達(dá)組IR分別為0.35% ± 0.14%、3.18% ± 0.21%、0.18% ± 0.04%，細(xì)胞遷移距離分別為（0.705 ±0.029）、（0.303 ± 0.049）、（0.859 ± 0.010）μm，細(xì)胞凋亡率分別為 4.02% ± 0.34%、21.94% ± 0.47%、3.12% ± 0.17%，IR AQP1過表達(dá)組＞對照組＞AQP1降表達(dá)組，細(xì)胞遷移距離、細(xì)胞凋亡率AQP1降表達(dá)組＞對照組＞AQP1過表達(dá)組（P均＜0.05）。

2.4 黃芩苷調(diào)控AQP1對PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 LTEP-A2細(xì)胞VEGF、IGF、mTOR、p-Akt、HIF-1α 蛋白表達(dá) AQP1過表達(dá)組＞AQP1過表達(dá)+黃芩苷組、AQP1過表達(dá)+LY294002組、AQP1過表達(dá)+wortmannin組（P均＜0.05），過表達(dá)+黃芩苷組、AQP1過表達(dá)+LY294002組、AQP1過表達(dá)+wortmannin組各項(xiàng)蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 黃芩苷調(diào)控AQP1對PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）

表1 黃芩苷調(diào)控AQP1對PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：與AQP1過表達(dá)組比較，*P＜0.05。

組別AQP1過表達(dá)組AQP1過表達(dá)+黃芩苷組AQP1過表達(dá)+LY294002組AQP1過表達(dá)+wortmannin組VEGF 0.906 ± 0.037 0.657 ± 0.025*0.623 ± 0.045*0.656 ± 0.034*IGF 0.711 ± 0.028 0.524 ± 0.078*0.546 ± 0.039*0.516 ± 0.029*mTOR 0.855 ± 0.017 0.759 ± 0.067*0.752 ± 0.048*0.760 ± 0.037*p-Akt 0.544 ± 0.039 0.392 ± 0.031*0.410 ± 0.051*0379 ± 0.021*HIF-1α 0.708 ± 0.046 0.480 ± 0.051*0.463 ± 0.028*0.469 ± 0.043*

3 討論

肺腺癌在肺癌中占比較高，雖然該病理類型病情發(fā)展緩慢、惡性程度低，但因?yàn)榇嬖谖⑥D(zhuǎn)移灶，使腫瘤細(xì)胞可通過血管和淋巴等途徑向遠(yuǎn)處播散，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是癌癥中晚期。目前，化療依然是肺腺癌治療的主要手段，但不良反應(yīng)及多藥耐藥的形成嚴(yán)重影響化療效果和患者生存質(zhì)量。因此，治療肺腺癌需要更有效的藥物及療法。中醫(yī)認(rèn)為，肺癌是由邪毒內(nèi)侵、肺絡(luò)受損、痰瘀阻肺導(dǎo)致，宜減少失氣、逆氣、血瘀、輸液、痰積、痰凝氣滯、瘀血阻絡(luò)。黃芩為唇形科植物，其干燥根味苦，性寒，歸肺、膽、脾、大腸、小腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血等功效。黃芩苷是黃芩的主要活性成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌特性，對心血管、肝臟和腎臟有保護(hù)作用［6］。前期研究顯示，黃芩苷在不同類型的惡性腫瘤中具有低細(xì)胞毒性和抗逆活性［7］。CHEN 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能夠通過PDK1/Akt信號通路抑制上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制NSCLC的進(jìn)展。龍進(jìn)［9］研究顯示，黃芩苷對肺腺癌細(xì)胞A549具有明顯的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。AQP是廣泛分布于人體組織中的一類跨膜疏水性蛋白家族，在細(xì)胞代謝、增殖以及各種器官組織生理功能過程中發(fā)揮跨細(xì)胞膜快速水轉(zhuǎn)運(yùn)功能。AQP1是最早發(fā)現(xiàn)于紅細(xì)胞膜上的水通道蛋白，位于質(zhì)膜中，生理上主要存在于紅細(xì)胞、腎臟、肺、血管內(nèi)皮、腦以及動脈粥樣硬化斑塊的血管平滑肌細(xì)胞上。研究發(fā)現(xiàn)，AQP1表達(dá)異常與前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，在腫瘤相關(guān)水腫、腫瘤血管生成及內(nèi)皮細(xì)胞遷移、腫瘤細(xì)胞外滲和轉(zhuǎn)移等腫瘤生物學(xué)中可能發(fā)揮重要作用［10］。

本研究結(jié)果顯示，使用黃芩苷處理LTEP-A2細(xì)胞后，LTEP-A2細(xì)胞AQP1表達(dá)降低，提示黃芩苷可下調(diào)AQP1表達(dá)。我們應(yīng)用CCK-8法檢驗(yàn)細(xì)胞的增殖率，發(fā)現(xiàn)黃芩苷可抑制LTEP-A2細(xì)胞增殖，同時(shí)AQP1過表達(dá)的LTEP-A2細(xì)胞增值能力高于AQP1降表達(dá)細(xì)胞，提示黃芩苷對LTEP-A2細(xì)胞增殖的這種抑制可能是通過下調(diào)AQP1表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞遷移是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移與擴(kuò)散的重要運(yùn)動形式，本研究劃痕實(shí)驗(yàn)表明，黃芩苷處理的LTEP-A2細(xì)胞遷移能力降低，同時(shí)AQP1過表達(dá)組細(xì)胞遷移能力明顯加快，提示黃芩苷可通過下調(diào)AQP1表達(dá)抑制肺腺癌細(xì)胞遷移。腫瘤細(xì)胞可通過凋亡信號的失調(diào)，尤其是抗凋亡系統(tǒng)的激活來逃避凋亡或程序性細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致惡性增殖、治療抗性和癌癥復(fù)發(fā)［11］。因此，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是許多抗癌藥物的重要作用方式之一。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)黃芩苷可增加LTEP-A2細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率，同時(shí)AQP1降表達(dá)亦能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示黃芩苷可通過下調(diào)AQP1表達(dá)誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞凋亡。

PI3K/Akt信號通路是體內(nèi)細(xì)胞增殖、分化和凋亡的重要代謝途徑。PI3K是參與細(xì)胞生長和增殖的基本酶，在包括肝癌在內(nèi)的人類癌癥中經(jīng)常被過度激活。PI3K/Akt信號通路在正常情況下參與細(xì)胞增殖、凋亡、代謝及轉(zhuǎn)錄翻譯等，但該通路異常活化后可抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和新血管生成。WANICZEK等［12］研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路異常活化后Akt可磷酸化mTOR、4EBP1等分子，向腫瘤細(xì)胞傳達(dá)生存信號。閆康鵬等［13］發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞生長因子可經(jīng)PI3K/Akt信號通路促進(jìn)VEGF表達(dá)，當(dāng)PI3K/Akt通路異常活化后，VEGF高表達(dá)，最終誘導(dǎo)結(jié)直腸癌血管形成和轉(zhuǎn)移。IGF通過激活I(lǐng)R-A/IGF-1R介導(dǎo)的PI3K/Akt信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，在調(diào)節(jié)代謝，細(xì)胞功能，生長和分化中起重要作用［14］。腫瘤血管生長是由缺氧介導(dǎo)的HIF-1α上調(diào)引發(fā)的。HIF-1α可激活轉(zhuǎn)錄因子缺氧反應(yīng)元件，誘導(dǎo)多種促血管生成因子的轉(zhuǎn)錄；同時(shí)，HIF-1α還可誘導(dǎo)分泌細(xì)胞因子VEGF的產(chǎn)生，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的生長［15］。由此，VEGF、IGF、mTOR、p-Akt、HIF-1α等相關(guān)蛋白與PI3K/Akt之間的相互作用基本明確。為進(jìn)一步詳細(xì)闡明黃芩苷下調(diào)AQP1表達(dá)影響肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的具體分子機(jī)制，我們采用Western blotting對PI3K/Akt信號通路中相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示AQP1過表達(dá)+黃芩苷組、AQP1過表達(dá)+LY294002（PI3Kα抑制劑）組、AQP1過表達(dá)+wortmannin（p-PI3Kα抑制劑）組VEGF、IGF、mTOR、p-Akt、HIF-1α蛋白表達(dá)較AQP1過表達(dá)組明顯降低，并且AQP1過表達(dá)+黃芩苷組、AQP1過表達(dá)+LY294002組、AQP1過表達(dá)+wortmannin組各通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示證明黃芩苷與其他兩組PI3Kα抑制劑作用相同，均可降低p-PI3K與Akt相關(guān)蛋白水平，抑制PI3K/Akt信號通路激活。同時(shí)，上述結(jié)果也表明，黃芩苷可能通過PI3K-Akt信號通路抑制AQP1表達(dá)，從而降低肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移，誘導(dǎo)其凋亡。

綜上所述，黃芩苷能夠有效抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與抑制PI3K／Akt信號通路的激活并下調(diào)AQP1表達(dá)相關(guān)。黃芩苷作為一種潛在的抗癌藥物，在未來可能會展現(xiàn)出更廣泛的應(yīng)用前景，本研究可為后來研究人員提供部分參考價(jià)值。