不穩定型心絞痛患者心外膜脂肪組織厚度及IL-1β表達水平與冠狀動脈易損斑塊形成相關性分析

陳博，談金強 ，祝和成，張峰，劉強

1 濟南市第四人民醫院心內科 濟南市心血管病研究所，濟南 250031；2 濟南市濟陽區人民醫院心內科；3 濟南市第四人民醫院心臟與大血管外科

心外膜脂肪組織（EAT）具有重要的代謝功能，是炎癥因子的重要來源，與冠狀動脈粥樣硬化存在密切聯系［1-2］。既往研究發現，EAT厚度與急性心肌梗死患者冠狀動脈病變嚴重程度存在相關性［3］。近期，有研究通過多層螺旋CT評估冠狀動脈斑塊及EAT體積，發現EAT體積與易損斑塊（VP）存在相關性［4］。但受限于分辨率，多層螺旋CT對VP的識別可能存在一定局限性。EAT可產生白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6等炎癥因子，IL-1β是炎癥反應和免疫調節的關鍵因子，與多種心血管疾病相關［5-7］。炎癥是動脈粥樣硬化的重要致病機制，外周循環和EAT局部的IL-1β都可能會影響粥樣斑塊的穩定性，但目前還沒有明確結論。因此，本研究擬探討EAT厚度及其組織中IL-1β與冠狀動脈VP的相關性。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 經濟南市第四人民醫院醫學倫理委員會批（批準號LL-20210006），選取2017年12月—2019年11月我院收治的不穩定型心絞痛患者。納入標準：接受冠狀動脈造影和冠狀動脈血管內超聲（IVUS）檢查確診為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病；接受擇期冠狀動脈旁路移植術；患者簽署知情同意書。排除標準：合并急性心肌梗死、活動性炎癥、既往冠狀動脈血運重建病史、急性心力衰竭、冠狀動脈慢性完全閉塞、心肌病、腫瘤。共收集符合上述條件的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者63例，進一步對患者冠狀動脈造影后對狹窄≥50%的主要血管進行IVUS檢查，并進行虛擬組織學分析。VP定義為至少連續三幀圖像上同時滿足斑塊負荷≥50%、壞死核心占斑塊面積比例≥10%、壞死核心表面無纖維斑塊成分［8］。根據虛擬組織學IVUS定義的VP將患者分為VP組24例，非VP組39例。同時，納入排除冠狀動脈粥樣硬化性心臟病需接受換瓣手術的心臟瓣膜病患者45例作為對照組。VP組男17例、女7例，年齡（65 ± 10）歲，BMI（24.5 ±3.2）kg/m2，收縮壓（142 ± 31）mmHg、舒張壓（79 ± 13）mmHg，心率（77 ± 14）次/分，高血壓11例，高脂血癥9例，吸煙10例，糖尿病8例，有冠心病家族史10例，總膽固醇（4.81 ± 1.07）mmol/L，高密度脂蛋白（1.15 ±0.19）mmol/L，低密度脂蛋白（2.91 ± 0.89）mmol/L，糖化血紅蛋白6.1% ± 0.8%，左心室射血分數57% ±7%；非VP組男23例、女16例，年齡（68 ± 11）歲，BMI（23.7 ± 3.6）kg/m2，收縮壓（141 ± 25）mmHg、舒張壓（79 ± 11）mmHg，心率（72 ± 17）次/分，高血壓16例，高脂血癥14例，吸煙15例，糖尿病14例，有冠心病家族史14例，總膽固醇（4.64 ± 1.14）mmol/L，高密度脂蛋白（1.28 ± 0.24）mmol/L，低密度脂蛋白（3.08 ±0.90）mmol/L，糖化血紅蛋白5.9% ± 0.9%，左心室射血分數59% ± 8%；對照組男32例、女13例，年齡（62 ±12）歲，BMI（22.8 ± 3.3）kg/m2，收縮壓（143 ± 29）mmHg、舒張壓（81 ± 20）mmHg，心率（80 ± 15）次/分，高血壓9例，高脂血癥9例，吸煙8例，糖尿病5例，有冠心病家族史10例，總膽固醇（4.86 ± 1.18）mmol/L，高密度脂蛋白（1.23 ± 0.26）mmol/L，低密度脂蛋白（3.0 ± 0.93）mmol/L，糖化血紅蛋白5.7% ± 0.9%，左心室射血分數56% ± 15%。三組年齡、性別、BMI、收縮壓、舒張壓、心率、血脂水平、左心室射血分數差異無統計學意義，高脂血癥、糖尿病、高血壓、吸煙、冠心病家族史等傳統冠心病危險因素在VP組及非VP組中發生率高于對照組（P均＜0.05），VP組與非VP組各臨床資料差異均無統計學意義。

2.2 EAT厚度測量方法 所有受試者均接受超聲心動圖檢查（飛利浦EPIQ-7C），檢查由同一名經驗豐富的超聲診斷醫生進行，選擇胸骨旁長軸切面測量右心室舒張末期游離壁的脂肪厚度［3］。選擇心臟S5-1探頭，頻率為3.5 MHz，深度設置15 cm。為減少誤差，將感興趣區放大以便于測量。連續測量3個心動周期的EAT厚度數值，取平均值。

2.3 血漿IL-1β表達檢測 采用ELISA法。采集受試者空腹肘靜脈血，血漿標本置于-80 ℃儲存，按照ELISA反應試劑盒（武漢谷歌生物科技公司）說明書測定血漿IL-1β。

2.4 EAT中IL-1β蛋白及mRNA表達檢測 開胸術后30 min內在患者右冠狀動脈近段心外膜區域取EAT中標本，用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗標本，并在-80 ℃下保存。①IL-1β蛋白表達：采用免疫組織化學法。將石蠟包埋的EAT標本連續切片，采用Envision二步法進行IL-1β免疫組化染色，一抗為抗IL-1β抗體，二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠抗體（武漢谷歌生物科技公司）。免疫組織化學檢測試劑盒由武漢谷歌生物科技公司提供，IL-1β蛋白陽性表達為棕黃色或黃色顆粒狀物質。②IL-1β mRNA表達：采用RT-PCR。取EAT標本50 μg，采用TRIzol法提取總RNA，反轉錄為cDNA，PCR擴增。PCR反應條件為：95 ℃ 45 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，循環30次。引物由武漢谷歌生物科技公司合成，IL-1β上游引物5'-TGGGATAACGAGGCTTATGTG-3'，下游引物5'-ATGGAGAACACCACTTGTTGC-3'；GAPDH上游引物5'-CCACGAAACTACCTTCAACTCC -3'，下 游 引 物5'-GGAGCAATGATCTTGATCTTCA-3'。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算IL-1β相對表達量。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料采用Kolmogorov-Smirnov正態性檢驗驗證是否服從正態分布，以±s表示，兩組數據比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析及Bonferroni校正；計數資料以例或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Spearman等級相關性分析VP組、非VP組EAT厚度及EAT中IL-1β水平與冠狀動脈VP的相關性，多因素Logistic回歸分析不穩定型心絞痛患者發生VP的影響因素，受試者工作特征（ROC）曲線評價EAT厚度對冠狀動脈VP的預測價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組EAT厚度比較 VP組、非VP組、對照組EAT 厚度分別為（6.1 ± 1.3）mm、（5.4 ± 1.5）mm、（4.6 ± 1.4）mm，EAT厚度VP組＞非VP組＞對照組（P均＜0.05）。

2.2 各組血漿IL-1β表達比較 VP組、非VP組、對照組血漿IL-1β表達分別為（0.25 ± 0.24）、（0.25 ±0.35）、（0.24 ± 0.36）pg/dL，三組血漿IL-1β表達差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 各組EAT中IL-1β蛋白及mRNA表達比較免疫組化染色顯示，EAT中IL-1β蛋白在VP組表達最多（OSID碼圖1）。VP組、非VP組、對照組EAT中IL-1β mRNA表達分別為6.13 ± 2.14、2.60 ± 0.93、2.09 ± 0.84，IL-1β mRNA表達VP組＞非VP組、對照組（P＜0.05）。

2.4 VP組、非VP組EAT厚度及EAT中IL-1β水平與冠狀動脈VP的相關性 Spearman相關性分析顯示，VP組、非VP組EAT厚度及EAT中IL-1β水平均與冠狀動脈VP呈正相關（r分別為0.34、0.67）。

2.5 不穩定型心絞痛患者發生VP的影響因素 多因素Logistic回歸分析顯示，EAT厚度、EAT中IL-1β水平是不穩定型心絞痛患者發生VP的獨立影響因素。見表1。

表1 不穩定型心絞痛患者發生VP的多因素Logistic回歸分析結果

2.6 EAT厚度對冠狀動脈VP的預測價值 ROC曲線分析顯示，EAT厚度預測冠狀動脈VP的曲線下面積為0.74（95%CI為0.64～0.84）；當EAT厚度截斷值為4.4 mm時，預測冠狀動脈VP的敏感度和特異度分別為95.8%和45.2%。見圖1。

圖1 EAT厚度預測冠狀動脈VP的ROC曲線

3 討論

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病［9］，炎癥參與了動脈粥樣硬化發生發展的各個階段。炎癥因子可以促進斑塊的形成，加快穩定斑塊進展為不穩定斑塊［10-11］。CHOI等［12］對人體動脈粥樣斑塊進行了動態隨訪，發現炎癥參與了VP的形成，而抑制炎癥活動可以增加斑塊的穩定性；如果相關的炎癥途徑被選擇性阻斷，斑塊體積會顯著減小。

斑塊破裂是急性冠脈綜合征最重要的致病機制。盡管近年來對動脈粥樣硬化的研究取得了很大的進展，但斑塊破裂的機制仍不完全清楚。一種觀點認為，局部炎癥因子可以釋放蛋白酶，抑制纖維帽形成，導致斑塊不穩定［13］。本研究結果顯示，EAT中存在關鍵炎癥因子IL-1β，且存在VP的患者EAT中IL-1β表達顯著增加，但IL-1β通過何種機制影響斑塊的穩定性還尚未可知。既往研究表明，IL-1β基因敲除小鼠動脈粥樣硬化嚴重程度顯著降低［14］。相關臨床研究也發現，針對IL-1β的治療可以改善心肌梗死患者預后，在標準治療基礎上加用IL-1β單克隆抗體可以將心肌梗死后心血管事件的發生風險降低15%［15］。因此，IL-1β信號途徑在VP的形成機制中可能有重要作用。本研究發現，VP患者EAT中IL-1β表達增加，支持IL-1β影響斑塊穩定性的觀點。外周循環中也可以檢測到IL-1β表達，但我們的研究發現外周循環中IL-1β水平與是否存在冠狀動脈VP無關。一種可能的解釋是：EAT局部IL-1β表達增加，可通過旁分泌形式作用于冠狀動脈粥樣斑塊，從而促進斑塊不穩定。

EAT是包裹在心臟和冠狀動脈表面的脂肪組織。在成年人心臟中，EAT覆蓋80%的心臟表面，大部分位于右心室表面。這也是本研究選擇右室游離壁作為超聲心動圖測量部位的原因。EAT和冠狀動脈之間有緊密的解剖和功能聯系，因此兩者間可能存在相互作用［16］。研究發現，EAT可通過內分泌和旁分泌產生炎癥因子和趨化素，而炎癥反應是粥樣斑塊形成、發展的重要因素，導致斑塊趨向于不穩定［17］。本研究結果顯示，EAT產生的IL-1β可能是影響冠狀動脈粥樣斑塊性質的一個重要因素。目前臨床上多采用CT或MRI測量EAT體積來探討其與心血管疾病的關系［17-18］。有研究發現，血清趨化素水平與EAT體積相關，可以預測患者心血管疾病發生的風險［17］。對房顫患者的研究發現，CT測量的EAT體積與心房電重構、結構重構相關，與房顫發生及射頻消融術后復發相關［19］。但這兩種檢查效率較低，可重復性差，難以普遍用于臨床篩查。超聲心動圖測量EAT厚度更為高效、經濟，可進行大樣本研究，并且易于動態隨訪觀察。本研究結果表明，存在冠狀動脈VP的患者EAT厚度顯著增加，并且EAT厚度及EAT中IL-1β水平是VP的獨立預測因子。

本研究存在一定的局限性。首先，冠狀動脈VP在臨床上較難界定，血管內超聲定義的VP并不完全等同于病理學定義的VP，但目前血管內超聲結合虛擬組織學是較為準確的檢測VP的方式。其次，這是一項單中心研究，同時滿足接受血管內超聲檢查及外科開胸手術的患者較難收集，因此入選患者數量有限。未來需要多中心、大樣本的研究來進一步驗證本文的發現并闡明EAT產生的IL-1β在VP形成中的具體作用機制。