過/降表達miR-92a的食管鱗癌細胞增殖、遷移、侵襲能力及PTEN/PI3K/Akt通路蛋白表達變化

周家田，尚觀勝，張聰，蔣德熊，袁冬冬，湯登堯，周江

成都市第七人民醫院胸外科，成都 610123

食管鱗狀細胞癌（ESCC）是食管癌的主要亞型，占所有食管癌病例的90%以上［1］。由于早期ESCC缺乏特異性癥狀，多數ESCC患者確診時已處于中晚期，因此造成ESCC患者的預后較差，5年生存率低于20%［2］。miRNAs是一種非編碼RNA，其與靶基因mRNA的3'-非翻譯區（3'-UTR）非特異性結合，抑制其翻譯或調節降解，以參與腫瘤的增殖、分化、遷移和凋亡［3］。目前已在多種腫瘤中發現miRNA的異常表達調控腫瘤進展，相關報道顯示，miR-92a可在結直腸癌［4］，肺癌［5］及 ESCC［6］等腫瘤中通過抑制多種不同的靶基因調節腫瘤的增殖、遷移及侵襲。YANSHEN等［7］研究表明，miR-92a可通過靶向抑制磷酸酯酶與張力蛋白同源物（PTEN）從而促進前列腺癌的增殖，提示miR-92a可能通過PTEN/磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/Akt通路發揮其生物學功能。而關于miR-92a對ESCC細胞生物學特性的影響及其相關機制的報道較少。2022年1月—6月，本研究通過靶向調控miR-92a表達，觀察了過/降表達miR-92a的ESCC細胞Eca-109增殖、遷移、侵襲能力及其與PTEN/PI3K/Akt通路的關系，以期為ESCC的臨床靶向治療提供必要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人ESCC細胞系Eca-109購自聯組生物科技有限公司。RPMI-1640培養基、10%胎牛血清均購自美國Thermo，miR-92a過表達（miR-92a mimic）、miR-92a降表達（miR-92a inhibitor）以及對應的陰性對照質粒（mimic-NC、inhibitor-NC）均購自中國Ribobio，LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Thermo，Hifair?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Super-Mix for qPCR試劑盒購自中國翊圣生物，CCK-8檢測試劑盒購自中國東仁化學，Matrigel購自美國BD Biosciences，光學顯微鏡購自日本Olympus。PTEN、磷酸化PTEN（p-PTEN）、Akt、p-Akt鼠抗人一抗購自中國三鷹生物，、PI3K一抗購自英國Abcam、p-PI3K一抗購自德國CST，GADPH一抗購自中國普健生物。

1.2 細胞培養及分組處理 將人食管鱗狀細胞癌細胞系Eca-109置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養。將Eca-109隨機分為miR-92a過表達組、miR-92a降表達組、過表達陰性對照組、降表達陰性對照組，通過LipofectamineTM2000分別轉染 miR-92a mimics、miR-92a inhibitor、mimic-NC、inhibitor-NC，轉染 24 h。采用qRT-PCR法檢測各組miR-92a相對表達量，使用TRIzol法提取總 RNA，使用 Hifair?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒合成和擴增 cDNA，使用 Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒檢測miR-92a表達水平，按照試劑盒說明書操作。利用miRBase軟件設計miR-92a引物序列，miR-20a-5p引物序列：上游引物5'-GCCGAGTATTGCACTTGTCC-3'、下游引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'，內參U6上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'、下 游 引 物 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。采用2-ΔΔCt法計算 miR-92a-5p相對表達量。結果顯示，miR-92a過表達組、過表達陰性對照組、miR-92a降表達組、降表達陰性對照組miR-92a相對表達量分別為（1.511 ± 0.270）、（1.186 ± 0.118）、（0.263 ±0.008）、（1.015 ± 0.086），miR-92a過表達組＞過表達陰性對照組、降表達陰性對照組＞miR-92a降表達組（P均＜0.05）；提示轉染成功。

1.3 細胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。將各組細胞接種到96孔板中，在培養24 h、48 h、72 h、96 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃下孵育2 h。按照說明書要求通過酶標儀檢測450 nm處的吸光度（A）值，以此評估細胞增殖能力。

1.4 細胞遷移能力觀察 采用劃痕愈合實驗。將處于對數生長期的ESCC細胞接種到預先標記好的6孔板中。待細胞鋪滿板底后，用10 μL移液管尖端，在具有胎牛血清的融合細胞單層上產生人工傷口（盡量確保各個劃痕寬度一致）。用PBS沖板3次，加入培養基在培養箱中培養。培養24 h后取出拍照，將劃痕的縮短距離用于確定遷移率。

1.5 細胞侵襲能力觀察 采用Transwell小室實驗。將Transwell小室置于24孔板中，該板用5 mL BD Matrigel預涂覆，并在37 ℃下孵育40 min。將不含FBS的0.1 mL培養基中的2×104個腫瘤細胞接種在上室中。在下室中，加入0.6 mL含有10% FBS的培養基。孵育48 h后，用4%多聚甲醛固定細胞，并用0.1% 結晶紫染色15 min，使用Olympus光學顯微鏡捕獲圖像，記錄侵襲細胞數。

1.6 細胞PTEN/PI3K/Akt通路蛋白檢測 采用Western Blotting法。收集轉染48 h后的各組細胞，使用含有新鮮蛋白酶抑制劑的冰冷裂解緩沖液中均質化制備細胞裂解物提取物。在4 ℃以12 000 r/min離心10 min后，獲得上清液，測定總細胞蛋白質濃度。將提取的蛋白質通過SDS-PAGE分離，并轉移至PVDF膜上。用含有5%脫脂牛奶的TBST閉膜后，將膜與PTEN、PI3K、Akt、p-PTEN、p-PI3K、p-Akt、GADPH一抗一起孵育。漂洗后，將膜在過氧化物酶連接的相應二抗中溫育2 h，對蛋白質膜進行染色，使用化學發光進行觀察，用BioRad Gel系統定量印跡，使用基于NIH Image的ImageJ定量掃描的染色條帶和像素強度，以目的蛋白條帶與內參GAPDH條帶灰度值的比值表示PTEN、PI3K、Akt、p-PTEN、p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達量。

1.7 統計學方法 采用SPSS21.0統計軟件。計量資料采用Shapiro-Wilk進行正態性檢驗，服從正態分布的資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用One-way ANOVA，重復測量資料采用重復測量方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞各時點增殖能力比較 各時點細胞A值比較， miR-92a過表達組＞過表達陰性對照組、降表達陰性對照組＞miR-92a降表達組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組細胞各時點增殖能力比較（±s）

表1 各組細胞各時點增殖能力比較（±s）

注：與過表達陰性對照組、降表達陰性對照組同時點比較，*P＜0.05。

組別miR-92a過表達組miR-92a降表達組過表達陰性對照組降表達陰性對照組細胞A值24 h 0.687 ± 0.041 0.556 ± 0.032 0.612 ± 0.009 0.602 ± 0.011 48 h 1.239 ± 0.035 0.750 ± 0.033 0.940 ± 0.011 0.917 ± 0.036 72 h 1.806 ± 0.051 0.813 ± 0.075 1.435 ± 0.024 1.362 ± 0.039 96 h 2.730 ± 0.256*1.169 ± 0.077*2.002 ± 0.024 2.062 ± 0.224

2.2 各組細胞遷移能力比較 miR-92a過表達組、miR-92a降表達組、過表達陰性對照組、降表達陰性對照組細胞遷移距離分別為（48.797 ± 2.654）、（22.799 ± 2.368）、（31.737 ± 1.878）、（33.714 ±3.508）μm，miR-92a過表達組＞過表達陰性對照組、降表達陰性對照組＞miR-92a降表達組（P均＜0.05）。

2.3 各組細胞侵襲能力比較 miR-92a過表達組、miR-92a降表達組、過表達陰性對照組、降表達陰性對照組穿膜細胞數分別為（245.333 ± 12.014）、（145.667 ± 9.452）、（177.667 ± 9.074）、（175.000 ±5.196）個，miR-92a過表達組＞過表達陰性對照組、降表達陰性對照組＞miR-92a降表達組（P均＜0.05）。

2.4 各組細胞PTEN/PI3K/Akt通路蛋白比較 p-PTEN蛋白miR-92a降表達組＞降表達陰性對照組、過表達陰性對照組＞miR-92a過表達組，p-PI3K、p-Akt蛋白miR-92a過表達組＞過表達陰性對照組、降表達陰性對照組＞miR-92a降表達組（P均＜0.05），各組PTEN、PI3K、Akt蛋白差異均無統計學意義。見表2。

表2 各組細胞PTEN、PI3K、Akt、p-PTEN、p-PI3K、p-Akt蛋白比較（±s）

表2 各組細胞PTEN、PI3K、Akt、p-PTEN、p-PI3K、p-Akt蛋白比較（±s）

注：與過表達陰性對照組、降表達陰性對照組同時點比較，*P＜0.05。

組別miR-92a過表達組miR-92a降表達組過表達陰性對照組降表達陰性對照組PTEN 0.646 ± 0.029 0.709 ± 0.059 0.765 ± 0.067 0.758 ± 0.083 PI3K 1.066 ± 0.116 0.750 ± 0.122 0.934 ± 0.105 0.966 ± 0.191 Akt 0.988 ± 0.072 0.754 ± 0.076 0.938 ± 0.117 0.933 ± 0.131 p-PTEN 0.209 ± 0.034*0.715 ± 0.035*0.475 ± 0.037 0.480 ± 0.044 p-PI3K 0.796 ± 0.067*0.258 ± 0.018*0.549 ± 0.071 0.565 ± 0.104 p-Akt 0.825 ± 0.016*0.344 ± 0.026*0.620 ± 0.043 0.621 ± 0.006

3 討論

miRNA是一類高度保守的具有組織特異性的非蛋白質編碼RNA，通過負向調控靶基因的表達來維持細胞穩態［8］。研究發現，miRNA的表達與癌癥的進展密切相關，其可以發揮致癌基因或者腫瘤抑制基因的作用調節細胞的增殖、遷移和凋亡等多個生物過程。如非小細胞肺癌（NSCLC）相關研究發現，miR-25過表達可以通過靶向FBXW7促進NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲［9］。多項研究表明，miR-92a可以促進腫瘤的發生發展。ZHOU等［10］研究發現，miR-92a在宮頸癌組織中顯著上調，且miR-92a過表達可以促進細胞周期從G1期向G2期轉變，從而顯著增強宮頸癌細胞的增殖和侵襲。TSUCHIDA等［11］研究顯示，miR-92a在結腸腺癌組織中表達增加，可直接靶向B淋巴細胞瘤2并抑制結腸癌細胞凋亡；而miR-92a抑制劑可誘導結腸癌細胞凋亡。此外，有研究顯示miR-92a-3p在ESCC中過表達，其可以通過調節PTEN的表達促進ESCC細胞增殖、遷移和侵襲［12］。本研究結果表明，過表達miR-92a可提高ESCC細胞的增殖、遷移和侵襲能力，抑制miR-92a表達可抑制ESCC細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

PTEN/PI3K/Akt信號通路可以激活下游多種效應分子，從而調節腫瘤細胞生長、分化、增殖、存活、侵襲、轉移，與人類多種惡性腫瘤的發生發展密切相關［7］。PTEN位于染色體10q23上，是一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，可負性調節PI3K/Akt細胞信號從而調控癌癥進展［13］。PTEN/PI3K/Akt對癌癥的調控作用受到miRNA異常表達的影響，如miR-21能夠促進PTEN/PI3K/Akt通路中Akt蛋白的磷酸化，降低PTEN蛋白的表達，進而促進卵巢癌細胞的增殖并減少腫瘤細胞凋亡［14］；miR-671能夠靶向抑制circSLC8A1表達，誘導PTEN下調，促進乳腺癌細胞中的PI3k/Akt信號轉導，進而促進乳腺癌的發生發展［15］。本研究結果顯示，上調miR-92a表達可以顯著抑制PTEN蛋白的磷酸化，并促進PI3K和Akt蛋白的磷酸化，進而促進ESCC細胞增殖、遷移及侵襲。

綜上所述，miR-92a可促進ESCC細胞的增殖、遷移及侵襲，其作用可能通過抑制PTEN蛋白磷酸化調控PTEN/PI3K/Akt信號通路實現，這也提示miR-92a可能作為ESCC治療的潛在靶點。本研究仍有一定不足之處，本研究僅探究miR-92a對ESCC細胞生物學行為以及PTEN/PI3K/Akt信號通路的影響，并未深入探究miR-92a靶向調控基因進行深入挖掘，未來將針對miR-92a的調控機制進行進一步探究。