普魯蘭多糖-明膠復合膜對大菱鲆的保鮮

劉恒睿，于鈺潔，孟錦濤，劉春娥

中國農業大學煙臺研究院（煙臺 264670）

大菱鲆（Scophthalmus maximus）是菱鲆屬魚類[1]，含有豐富的氨基酸、多不飽和脂肪酸及維生素[2]。水產品死后易腐敗，延長其貨架期一直是研究的熱點。可食膜保鮮具有操作簡單、效果好、無污染等特點，被逐步應用于水產品的保鮮[3-4]。根據使用的基材不同，可食膜可分為多糖類、蛋白類、脂質類及復合類[5]。復合膜中多糖、蛋白質的種類、含量不同，膜的性質也不同，可滿足不同食品的保鮮需要。

普魯蘭多糖具有耐酸堿性、吸附性、黏稠性、可降解性、成膜性和膜不透性[6-7]。Chen等[8]以2%～3%的普魯蘭多糖處理冷藏下的尼羅魚片，結果發現魚片的感官評價有所改善。明膠具有可降解性，可抑制褐變，防止吸潮，保持食品風味。Antoniewski等[9]使用20%的明膠保鮮4 ℃下貯藏的鮭魚，結果發現其汁液損失率顯著降低。明膠與多糖的相容性優良，與二者的單膜相比，復合膜的抗氧化性、抑菌性和阻隔性能均得到了改善[10]。董汝月等[4]使用6%的明膠和2%殼聚糖溶液制作成膜液，結果發現其可延緩4 ℃下南美白對蝦的黑變。

此次試驗研究了普魯蘭多糖-明膠復合膜對低溫下大菱鲆魚片的保鮮效果，通過測定魚片的感官評價、pH、持水力、TBA值、TVB-N含量、菌落總數和優勢菌，分析保鮮劑在延緩冷藏下大菱鲆魚片腐敗的作用，為大菱鲆的保鮮提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮大菱鲆（煙臺市高新區漁窩窩海鮮超市），每條質量1±0.2 kg，30 min內帶水活運至實驗室。

食品級普魯蘭多糖、食用明膠（河南萬邦實業有限公司）；PCA瓊脂培養基（杭州微生物試劑有限公司）；硼酸（AR）、丙三醇（AR）、碳酸鉀（AR）、乙二酸四乙酸二鈉（AR）、無水乙醇（AR）、2-硫代巴比妥酸（AR）、三氯乙酸（AR）、1, 1, 3, 3-四乙氧基丙烷（AR）：國藥集團化學試劑有限公司；0.01 mol/L鹽酸標準滴定液、甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑（廣州和為醫藥科技有限公司）；生理氯化鈉溶液（安徽豐原藥業股份有限公司）。

1.2 儀器與設備

PHS-3C型pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；TGL-16G型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；UV754N型紫外可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）；DH209D型電熱恒溫培養箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；BHS-6型數顯恒溫水浴鍋（江陰市保利科研器械有限公司）；BL-388型冷藏展示柜（青島英迪菲電器有限公司）；MGC-100型光照培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 涂膜保鮮液的制備

配制3種保鮮液，分別為0.1%的普魯蘭多糖溶液，1.5%的明膠溶液和0.1%普魯蘭多糖+1.5%明膠混合溶液，各500 mL，置于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 大菱鲆魚片的制備

鮮活大菱鲆剖殺后去頭、尾及內臟，將背部新鮮魚肉去皮后切成3 cm×3 cm×1 cm的魚片，用生理氯化鈉溶液沖洗干凈，瀝水。

1.3.3 涂膜處理

試驗設四個組別，即空白組、多糖組、明膠組和復合組。將魚片隨機分組，浸泡于對應涂膜液中，5 min后取出，置于潔凈干燥的封口袋中于4 ℃冰箱中保存。

1.3.4 指標測定

以樣品處理當天為第0天，分別于第0，第2，第4，第6，第8，第10，第12和第14天測定各組pH、TVB-N含量、TBA值并進行感官評價，于第0，第2，第4，第6和第8天測定各組持水力及菌落總數。

1.3.4.1 感官評價

感官評定由5名有感官評定經驗的人員進行，分值由低到高為1～5分。從色澤、氣味、質地和紋理等方面分別對各組魚片進行評分，具體評分標準見表1。

表1 大菱鲆魚片綜合感官評價表

1.3.4.2 pH測定

參照 GB/T 9695.5—2008《肉與肉制品pH測定》[11]對各組魚片的pH進行測定。

1.3.4.3 持水力的測定

稱取1 g（精確到0.001 g）魚肉，用脫脂棉包好，放入5 mL離心管中，在9 000 r/min下離心10 min。取出樣品，除去脫脂棉，稱肉樣重。按式（1）計算持水力。式中：W1為離心前樣品的質量，m；W2為離心后樣品的質量，m。

1.3.4.4 TVB-N含量的測定

參照 GB 5009.228—2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》[12]測定各組TVB-N含量。

1.3.4.5 TBA值的測定

參照GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的測定》[13]測定各組TBA值。

1.3.4.6 菌落總數的測定

參照 GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數的測定》[14]測定各組菌落總數。

1.3.4.7 優勢菌的測定

選取空白組第3天的樣品、多糖組和明膠組第4天的樣品、復合組第6天的樣品進行優勢菌的測定。

從1.3.4.6小節中選擇菌落數為30～300的平板，挑取優勢菌落，采用2216E培養基分離純化，培養基配方見表2。

表2 2216E培養基的配方（1 L）

使用Tris飽和酚-氯仿法[15]提取純化后的細菌DNA并檢測濃度。PCR擴增采用細菌通用引物27F、1492R（由生物公司合成）。PCR反應體系見表3。

表3 50 μL的PCR擴增反應體系

PCR反應程序：94 ℃，預變性5 min；94 ℃，變性0.5 min；55 ℃，退火0.5 min；72 ℃，復性1.5 min；72 ℃延伸10 min；重復以上步驟35次。

進行1%的瓊脂糖凝膠電泳及成像分析。將擴增后的DNA送往生物公司測序，將結果與NCBI數據庫中的序列進行對比，確定優勢菌屬。

1.3.5 數據處理與分析

每組設置3個平行，使用SPSS 23.0軟件統計分析，使用Origin 9.8和Adobe Illustrator 2022軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 感官評價

圖1為各組在保鮮過程中的感官評分變化。隨保鮮時間延長，各組感官評分均降低（圖1）。具體表現為魚肉變黃，失去光澤，產生腥臭味，肌肉松散，肌纖維模糊，這是由于腐敗菌及酶分解了魚肉中的營養物質，導致肌肉組織破壞。0～14 d期間，復合組的評分均優于其他三組，這說明復合膜處理能更好地改善魚片的感官評價，這一結果與董汝月等[4]明膠-殼聚糖復合膜的結論相符。普魯蘭多糖和明膠間具有較強的分子作用力和優良的相容性，使復合膜具有較高致密性和拉伸強度，從而使復合膜的氧氣透過率低于二者的單膜，且多糖可抑制活性氧自由基的生成，終止自由基鏈的發生[16]，從而抑制營養物質的氧化，使魚片的感官評價維持在較高水平。

圖1 大菱鲆魚片保鮮過程中感官評分的變化

2.2 pH

魚片初始pH為7.1～7.3，隨時間的延長，各組均呈現先降低后升高的趨勢（圖2）。0～4 d期間，處理組pH均低于空白組，這可能是由于涂膜液的包覆制造了無氧環境，促進了厭氧菌的無氧呼吸，較空白組產生了更多的酸性物質。6～14 d期間，多糖組、明膠組及復合組的pH變化均較空白組緩慢，這與Jiang[17]的研究結果一致，這表明涂膜處理可有效降低氧氣與魚肉的接觸，從而降低魚肉中的微生物數量，延緩蛋白質的分解[18]，且多糖可與魚體內某些酶的活性中心外的氨基酸殘基結合，從而抑制酶的活性[16]。

圖2 大菱鲆魚片保鮮過程中pH值的變化

2.3 持水力變化

隨保鮮時間的延長，各組持水力均呈下降趨勢（圖3）。保鮮8 d后，空白組、多糖組、明膠組及復合組的持水力分別下降了11.30%，9.60%，6.97%和4.37%。8 d時，多糖組持水力顯著低于明膠組及復合組（P＜0.05），這可能是由于多糖內部的分子作用力使多糖單膜具有一定的孔隙，隔絕氧氣和水的能力較差[16]，魚肉內微生物活性較強，肌原纖維蛋白降解較快，產生大量堿性物質，在使魚肉pH上升的同時降低了魚肉的持水力。8 d時，復合組持水力顯著高于其他組別（P＜0.05），說明復合膜在魚片表面形成了更為致密的保護層，延緩了魚片表面微生物對魚肉蛋白質的降解[19]，且多糖能夠抑制蛋白酶的活性，從而保持肌球蛋白的結構，使持水力維持在較高水平。

圖3 大菱鲆魚片保鮮過程中持水力的變化

2.4 TVB-N含量變化

圖4為貯藏期間各組TVB-N含量的變化，以30 mg/100 g作為限值。初始時各組TVB-N含量均為2 mg/100 g左右。0～4 d期間，各組TVB-N含量增長緩慢，4 d后空白組增長迅速，在第6天時達到28.2 mg/100 g，在第8天超過限值，且顯著高于其他三組（P＜0.05）。復合組在第12天超過限值，此時多糖組和明膠組TVB-N含量分別為29.4和28.0 mg/100 g，接近限值，與復合組差異不顯著（P＞0.05）。覆膜處理可抑制TVB-N的產生，延緩菌落總數的增加，這是由于兩種保鮮劑均具有較為優良的阻氧性，可抑制酶和細菌的生物活性[20-21]，同時多糖具有一定的抑菌性[22]，能夠破壞細菌的細胞壁和細胞膜并分解細菌成分，使菌落總數下降，減弱細菌分解魚體肌肉的能力[23]，延緩蛋白質的降解，抑制TVB-N的增加。

圖4 大菱鲆保鮮過程中TVB-N含量的變化

2.5 TBA值變化

TBA值可以指示水產品的脂肪酸敗程度[24]。一般認為TBA值達到2 mg/kg時，魚體脂肪氧化嚴重，已不適合食用[25]。圖5為貯藏期間各組TBA值的變化。各組初始值均在0.6～1.0 mg/kg，隨貯藏時間的延長，各組TBA值均上升。其中：空白組TBA值增加最快，于第2天超過2 mg/kg，顯著高于其他處理組（P＜0.05）；多糖組于第4天超過2 mg/kg，顯著高于復合組（P＜0.05）；明膠組和復合組于第6天接近2 mg/kg，于第7～第8天超標。試驗結果表明，涂膜處理可抑制TBA的增加，這是由于多糖和明膠均具有良好的成膜性[14-26]，可阻止氧氣與魚肉的接觸，減緩魚體的褐變，抑制TBA值增加，使魚肉保持較為良好的色澤。復合組TBA值低于其他三組，說明復合膜阻氧性更強[27-28]，且能夠延緩魚肉中活性氧自由基和丙二醛的產生，從而提高魚肉的抗氧化性[29]。試驗中明膠組保鮮效果優于多糖組，這與楚銀鳳等[30]的試驗結果一致，這是由于明膠中脯氨酸的氨基和羥脯氨酸的羥基可與其他氨基酸及水分子形成氫鍵，利于維持其類三螺旋結構，從而使明膠的阻氧性能優于普魯蘭多糖。

圖5 大菱鲆保鮮過程中TBA含量的變化

2.6 菌落總數變化

菌落總數可反映肉制品受污染的程度，是評價保鮮效果的重要指標。各組菌落總數變化如圖6所示，以6 lg CFU/g為限值。隨保鮮時間的延長，各組別菌落總數均呈增長趨勢。其中，空白組在第4天已明顯超過限值，且顯著高于其他三組（P＜0.05），明膠組與多糖組菌落總數在第4天已接近限值，復合組于第6天已接近限值。相比于單膜處理，復合膜處理可有效抑制菌落的生長，這可能歸因于多糖可破壞致病菌的分子結構，阻礙細菌的能量代謝，從而起到殺菌的作用[31]，且明膠可抑制褐變，防止食品吸潮并阻止微生物的侵入[32]。

圖6 大菱鲆保鮮過程中菌落總數的變化

2.7 優勢腐敗菌的鑒定

以純化后的優勢菌DNA為模板進行PCR擴增，將擴增后的基因片段進行瓊脂糖凝膠電泳，所得圖譜如圖7所示。電泳獲得的四條條帶大小均在1 500～1 700 bp之間，說明優勢菌基因組總DNA片段大小合適，DNA降解較少，完整性較好。

圖7 菌株的PCR擴增產物電泳圖

表5 多糖組腐敗菌16S rDNA鑒定結果

表6 明膠組腐敗菌16S rDNA鑒定結果

各組腐敗菌16S rDNA鑒定結果如表4～表7所示。空白組優勢菌屬為芽孢桿菌（Bacillus），多糖組及明膠組優勢菌屬均為嗜冷桿菌（Psychrobacter），復合組優勢菌屬為希瓦氏菌屬（Shewanella），以上結果置信度均達到98.80%以上。地衣芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，為一種普遍存在的兼性好氧菌，能以內孢子的形式存在于水生動物的腸道內[33]；嗜冷桿菌屬于好氧菌，可在-10～42 ℃的范圍內生長，在多種水產品中均有檢出[34]，程三紅等[35]發現鮐魚體表的特定腐敗菌是嗜冷桿菌屬；希瓦氏菌屬革蘭氏陰性菌，是水產品主要的優勢腐敗菌，可在缺氧條件下快速繁殖，并將三甲胺-N-氧化物還原為三甲胺，水解蛋白質和脂肪，產生魚腥味。

表4 空白組腐敗菌16S rDNA鑒定結果

表7 復合組腐敗菌16S rDNA鑒定結果

藍蔚青等[36]發現帶魚經10 g/L殼聚糖保鮮液涂膜處理后在低溫下貯藏，菌相逐漸單一，嗜冷桿菌的生長受到抑制，這與試驗結果不同，可能是由于試驗中多糖組的濃度偏低導致的抑菌效果不明顯。預試驗表明，普魯蘭多糖溶液濃度過高會影響魚片感官，且溶解速度較慢，因此選擇0.1%的多糖濃度。相比于單膜處理，混合后的多糖和明膠形成了均一的體系，明膠與多糖分子間的相互作用破壞了二者的自聚力，因而具有較好的相容性[37]，提高復合膜的機械性能。此外復合膜內部分子間有較強的氫鍵和分子間作用力，使氧氣不易通過，可有效抑制芽孢桿菌及嗜冷桿菌等需氧菌的生長[38]。劉劍俠[39]發現在多糖中加入茶多酚可以有效抑制希瓦氏菌的腐敗，多糖和茶多酚的協同作用使復合膜的抑菌效果更加優良，這也為我們今后的試驗設計提供思路。

3 結論

研究以普魯蘭多糖和食用明膠為原料，在4 ℃下探究普魯蘭多糖-明膠復合膜對大菱鲆魚片品質的影響。結果表明：復合膜具有良好的阻氧性，在維持魚肉的感官評價、保持魚體肌肉結構、降低脂肪的氧化速率、抑制微生物生長等方面具有協同增效作用，能夠使大菱鲆魚片的冷藏貨架期由3～4 d延長至6～7 d，有著廣闊的應用前景。