響應面法優化微波輔助黃酒酒糟木糖提取工藝

曹卓華，魯姣，應雨婷，樓悅，孫小紅，周瑾

紹興文理學院元培學院（紹興 312000）

黃酒是以稻米等糧食作為原材料，經蒸煮、加曲、發酵和壓濾等多道工序釀成，作為其主要副產物的黃酒酒糟，含有相當豐富的淀粉、蛋白質和脂肪等營養物質[1]。據中國國家統計局數據顯示，2021年中國黃酒產量達360萬 t，黃酒出糟率高，每產1萬 t黃酒約有720 t黃酒糟廢棄，也就意味著每年約25.9萬 t黃酒糟生成。這些黃酒糟中營養物質豐富，如若不經過處理回收，不僅導致資源的浪費，而且容易造成河道堵塞，微生物肆意繁殖，影響動植物的生存，導致環境污染[2]。黃酒酒糟常用于制作動物飼料[3]、制備食醋[4]、醬油[5]和制曲[6]等。黃酒酒糟中含有豐富的半纖維素，這些半纖維素可以分解為木糖及其他戊糖等，其中木糖可作為木糖醇等重要工業產物的原料，通過中和脫酸工藝[7]生產木糖醇，這將極大提高黃酒酒糟的再利用率。

常用的酒糟中半纖維素水解為木糖的制取工藝包括酸水解法[8]和酶水解法[9]。傳統的酸水解法制取木糖過程中，為達到適合的反應溫度，常使用傳統熱源對反應物進行加熱，熱效率低下，反應時間較久[10]。試驗采用微波輔助酸水解法使黃酒酒糟中的半纖維素水解，以此制取木糖。為達到優化提取工藝的目的，設計相應的單因素試驗并應用響應面法綜合分析木糖的最優制取條件，以獲得更為高效的酒糟木糖制取方案，為黃酒酒糟的再利用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃酒酒糟（紹興市某酒廠）；D-木糖標準品（≥99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、3, 5-二硝基水楊酸、苯酚、無水亞硫酸鈉、硫酸等（均為分析純）。

1.2 儀器與設備

MDS-6G多通量微波消解/萃取系統（上海新儀微波化學科技有限公司）；CXC-06粗纖維測定儀（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；722N可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；KDN-BI定氮儀（上海新嘉電子有限公司）；KDN-08C數顯溫控消化爐（上海新嘉電子有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃酒酒糟基本成分測定

1.3.1.1 灰分測定

稱取5 g（精確至0.001 g）干燥黃酒酒糟樣品，置恒重坩堝中于電熱板上加熱充分炭化至無煙，置于高溫爐中550 ℃灼燒4 h，冷卻至200 ℃左右取出，在干燥器中冷卻30 min，重復灼燒至恒重，稱量，計算灰分[11]。

1.3.1.2 粗纖維測定

稱取2 g黃酒酒糟粉末，放入500 mL三角瓶中，加200 mL已沸騰的硫酸溶液，立即加熱，使其在2 min內沸騰并保持微沸30 min。抽濾后用已沸騰的氫氧化鈉溶液（0.313 mol/L）將殘渣轉移至原容器中并加至200 mL，同上微沸30 min，隨后立即在鋪有石棉的古氏坩堝上過濾，先用25 mL硫酸溶液（0.128 mol/L）洗滌，然后將殘渣轉移至坩堝中，用沸蒸餾水洗至pH 7，再用15 mL乙醇洗滌后抽干。將坩堝放入烘箱，于130 ℃烘干2 h，接著在干燥器中冷卻至室溫，稱量，再于550 ℃馬弗爐中灼燒30 min，取出后于干燥器中冷卻至室溫后稱量，計算粗纖維含量[12]。

1.3.1.3 蛋白質測定

采用凱氏定氮法[13]。

1.3.1.4 脂肪的測定

精密稱取5 g干燥黃酒酒糟，置于干燥至恒重的接收瓶中，加入石油醚于索氏提取器中抽提回流8 h，旋轉蒸發回收石油醚，待溶劑剩余約2 mL時水浴蒸干，并于100 ℃干燥1 h，于干燥器中冷卻0.5 h，重復以上操作至恒重，計算脂肪含量[14]。

1.3.2D-木糖標準曲線的繪制

試驗采用DNS分光光度法測定木糖含量，在波長540 nm處測定樣品的吸光度[15]。配制1 mg/mL的標準D-木糖溶液，分別取0，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6和0.7 mL標準溶液于25 mL容量瓶中，繼續加2.0 mL蒸餾水，各加入2 mL 3, 5-二硝基水楊酸（DNS），在沸水浴中煮沸5 min，迅速冷卻至室溫，并用蒸餾水定容至25 mL，混合均勻。在540 nm波長處用分光光度計分別測定各管的吸光度。設吸光度（A）為縱坐標、濃度（c）為橫坐標繪制標準曲線。標準曲線方程為A=22.65c-0.036 9（R2=0.999 1），線性關系良好。

1.3.3 單因素試驗

精密稱取0.5 g黃酒酒糟粉末至微波反應釜中，研究液料比（3∶1，5∶1，10∶1，15∶1和20∶1 mL/g）、硫酸濃度（1%，2%，3%，4%，5%和6%）、微波功率（300，400，500，600，700和800 W）、微波時間（1，3，5，7和9 min）4個因素對黃酒酒糟中木糖提取的影響，為響應面優化試驗提供合適的因素水平范圍。根據試驗過程中的實際液料比加入一定量的稀硫酸溶液，搖勻，使黃酒酒糟粉末與稀酸溶液充分接觸。把微波反應釜置于微波反應系統中進行微波輔助酸水解反應。反應結束后，待反應物冷卻至室溫，將所獲得的水解產物進行過濾，去除殘渣，濾液轉移至25 mL容量瓶中用蒸餾水定容，搖勻，作為待測溶液。

黃酒酒糟中木糖含量的測定參照1.3.2中的D-木糖標準曲線來測定黃酒酒糟中木糖含量（mg/g），按式（1）計算。

式中：c為由標準曲線線性回歸方程計算所得到的質量濃度，mg/mL；N為稀釋倍數；V為定容后的待測酸水解液的體積，mL；m為稱取的黃酒酒糟粉末質量，g。

1.3.4 響應面分析法試驗設計

在單因素試驗基礎上，選擇微波功率，將液料比（A）、硫酸濃度（B）、微波時間（C）3個因素為自變量，然后根據Box-Behnken試驗的設計原理來制定相關的因素的發展水平，可見表1。

表1 響應面因素與水平

1.4 數據處理

試驗所得的結果采用SPSS 22.0分析，并用Design Expert v13.0分析試驗結果。

2 結果與討論

2.1 黃酒酒糟成分測定與分析

黃酒酒糟成分測定結果如表2所示。黃酒酒糟中含量最高的是蛋白質，其次是粗纖維，脂肪含量較低。黃酒酒糟的再利用大多數是基于黃酒酒糟中蛋白質含量高的特點而在畜牧業和食品行業予以開發。黃酒酒糟中的纖維素含量也較為可觀，但開發利用不充分。

表2 黃酒酒糟成分分析 單位：%

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 液料比的影響

由圖1可知，保持其他因素不變，隨著液料比的增加，樣品中D-木糖含量也隨之增加，并在液料比5∶1 mL/g處出現最大值。其原因可能是在液料比過低時，液相中的水量較少，酸水解產生的木糖難以充分而快速地擴散溶入水中，從而導致反應速率減慢，木糖產率降低。綜合考慮，選擇液料比5∶1 mL/g較為合適。

圖1 液料比對木糖得率的影響

2.2.2 硫酸濃度的影響

由圖2可知，保持其他因素不變，隨著硫酸濃度的增加，樣品中的D-木糖含量也隨之增加，并在硫酸濃度4%處出現最大值。其可能的原因是在酸水解的過程中，硫酸濃度的增加使得氫離子濃度也隨之增加，氫離子同黃酒酒糟中半纖維素的醚鍵結合的概率也就越大，其酸水解為木糖的速率也隨之增加[16]。且硫酸濃度較低時，生物質中的無機陽離子和灰分也會與水解液中的氫離子發生離子交換反應[17]，從而進一步使氫離子濃度降低，降低反應速率，使木糖的產率降低。硫酸濃度繼續增大時，樣品中的D-木糖含量反而呈現降低趨勢，可能是過高的硫酸濃度會導致木糖被氧化，同時木糖在酸的催化下進一步脫水生成糠醛。綜合考慮，選擇硫酸濃度4%較為合適。

圖2 硫酸濃度對木糖得率的影響

2.2.3 微波功率的影響

由圖3可知，保持其他因素一定，微波功率300 W時，樣品中的D-木糖含量有最大值，隨著微波功率的增加，木糖含量開始下降?？赡茉诤线m的微波功率下，微波的輻射使得極性分子間的碰撞更加頻繁與劇烈，使得木糖的溶出增加，反應速度加快。同時，硫酸分子間會形成氫鍵，而使得氫離子濃度降低，反應速率變慢。合適功率下的微波輻射會使溫度升高，促進氫離子電離，加快反應速率[18]，提高木糖產率。而過高的微波功率的輻照則會導致木糖的焦化及Maillard反應的發生[16]，使得木糖的產率下降。綜合考慮，選擇微波功率300 W較為合適，后續響應面試驗微波功率直接設置為300 W。

圖3 微波功率對木糖得率的影響

2.2.4 微波時間的影響

由圖4可知，保持其他因素一定，隨著微波時間的增加，樣品中的D-木糖含量也隨之增加，并在微波時間5 min處出現最大值。隨著微波時間的增加，黃酒酒糟中的半纖維素的水解程度也隨之增加，并逐漸達到水解完全。繼續增加微波時間，樣品中的D-木糖含量呈下降趨勢，可能是半纖維素完全水解為木糖后，副反應進行速率增加，木糖脫水生成糠醛的反應進行程度逐漸加大，產生的木糖被消耗，導致木糖產率降低。綜合考慮，選擇微波時間5 min較為合適。

圖4 微波時間對木糖得率的影響

2.3 響應面分析

2.3.1 響應面結果

表3為試驗響應面試驗設計與結果，表4為數據方差及顯著性檢驗分析。

表3 響應面試驗設計與結果

表4 響應面回歸模型的方差分析及顯著性檢驗

通過Design Expert v13.0軟件將3個因素與響應值Y進行回歸擬合，得到木糖取得量（Y）的多元二次回歸擬合方程（各因素水平值為編碼制）：Y=93.02-2.40A+2.27B+15.90C-3.06AB+16.77AC-2.52BC-10.32A2-7.03B2-17.47C2。

通過對比預測值與實際值，其R2=0.836 8，表明二者較為接近，試驗誤差較小，實際值相對預測值的偏離較小，該模型較為有效。

由表4可知：該模型F值為3.99，P值=0.040 9（＜0.05），說明試驗的模型水平差異具有顯著性（P＜0.05）；同時該模型的失擬項P=0.125 9（＞0.05），表明模型失擬項差異不顯著，模型擬合度較高。模型可應用于分析與預測黃酒酒糟在不同水解條件下的木糖得率。在方程中，一次項C微波時間對于木糖的得率的影響極為顯著，二次項C2對于木糖得率有著顯著影響。而交互項AC對于木糖得率的影響顯著。這表明因素對于響應值的影響不是線性關系，其交互作用也對響應值有影響。對于黃酒酒糟中的木糖得率的各因素作用強度中，C＞A＞B，即微波時間＞液料比＞硫酸濃度；兩因素間的交互作用強度中，AC＞AB＞BC，即液料比與微波時間的交互作用＞液料比與硫酸濃度的交互作用＞硫酸濃度與微波時間的交互作用強度。

2.3.2 響應面圖形分析

圖7 硫酸濃度和微波時間對木糖得率的響應面分析

響應面等高線圖的形狀反映2種因素間交互作用的強弱。等高線圖越偏向于圓形，2種因素間的交互作用就越弱；等高線圖越偏向于橢圓形，2種因素間的交互作用就越強。如圖5所示，液料比與硫酸濃度及硫酸濃度和微波時間的交互作用等高線圖更偏向于圓形，其交互作用較?。粓D6顯示液料比與微波時間的交互作用等高線圖更偏向于橢圓形，其交互作用較大。等高線排列的密集程度也反映2種因素的變化對于響應值的影響程度。其中，液料比和微波時間的交互作用等高線圖等高線排列較為密集，二者的交互作用的影響也呈顯著水平。根據三維曲面圖可知，各個響應面均為凸面，表明模型在該試驗范圍內存在最大值的穩定點。

圖5 液料比和硫酸濃度對木糖得率的響應面分析

圖6 液料比和微波時間對木糖得率的響應面分析

2.3.3 最優工藝條件的確定及模型驗證

通過Design Expert v13.0軟件對于回歸模型的分析可得，在液料比9.03∶1 mL/g、硫酸濃度4.30%、微波時間7 min條件下，最優條件下的木糖得率為100.66 mg/g。在實際條件下依照該條件進行試驗以驗證模型預測的準確性。驗證結果表明，3個平行試驗中，木糖平均得率為98.06 mg/g，與理論預測值較為接近，證實該最優條件下的木糖制取工藝的準確性。

3 結論

在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken響應面分析法優化微波輔助黃酒酒糟中木糖的制取工藝，得出最優條件：液料比9.03∶1 mL/g、硫酸濃度4.30%、微波時間7 min，木糖最高取得量為100.66 mg/g。該最優工藝參數可為黃酒酒糟木糖的進一步研究提供基礎。

黃酒酒糟的酸水解所制取的木糖可作為工業原料來生產木糖醇[19]、糠醛[20]等重要產物，促進黃酒酒糟的廢物再利用，為釀造工業的生態保護提供新思路。此外，微波加熱法具有高效、節能的特點，其與工業生產及試驗中物質提取的有機結合可使產業及科學研究效率大幅提高。黃酒酒糟中還含有大量蛋白質、氨基酸、黃酮等物質，黃酒酒糟的進一步開發利用在醫藥、食品及化妝品領域有著深厚的潛力與廣闊的市場前景。