雞肉凍干粉中磺胺類藥物殘留標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制

賈潤宇，呂錚，王一名，余麗波，張凡，余洋*

1. 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院（北京 100176）；2. 中檢科（北京）測試認(rèn)證有限公司（北京 100176）

磺胺類藥物具有抗菌譜廣、藥效穩(wěn)定、療效確實、價格低廉、使用方便等[1-2]優(yōu)點(diǎn)，使其在畜牧及動物醫(yī)療領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。磺胺類獸藥能通過動物代謝從而污染環(huán)境，破壞生態(tài)環(huán)境，影響人身健康[3-5]。因此，對動物源中磺胺藥物殘留開展嚴(yán)密監(jiān)控對保障食品質(zhì)量安全和人民身體健康具有重要意義。為保證監(jiān)測結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，需要相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為支撐，然而查閱國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源共享平臺[6]，未見動物源基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。國內(nèi)對于獸藥殘留基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究及研制尚處在初級階段。郭德華等[7]研制含氯霉素、克倫特羅和沙丁胺醇的魚粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；李杰[8]研制含磺胺類及雌激素類獸藥的動物性食品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品；李蘭英[9]研制含磺胺類獸藥的豬組織基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品；呼念念[10]研制含硝基呋喃類獸藥的雞肉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品。在基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)方面，只有蜂蜜和牛乳粉國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，無法滿足基質(zhì)中磺胺類藥物殘留的準(zhǔn)確測定。因此，試驗應(yīng)用真空冷凍干燥技術(shù)、均勻化技術(shù)，以雞肉為本底基質(zhì)制備雞肉中磺胺類藥物殘留標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并經(jīng)均勻性檢驗、穩(wěn)定性檢驗和實驗室聯(lián)合定值[11-12]，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于實驗室質(zhì)量控制、能力驗證等，對于我國的獸藥殘留檢測技術(shù)的提升具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

磺胺甲基嘧啶固體標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.8%，上海安譜實驗科技股份有限公司）；磺胺二甲基嘧啶固體標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.8%，上海安譜實驗科技股份有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司）；甲酸（分析純）、磷酸鹽緩沖液[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；Na2EDTA緩沖液（天津市百世化工有限公司）。

雞肉購買于超市。

MSM764M斬拌機(jī)（北京馬多機(jī)械制造有限公司）；ms205du精密電子天平（瑞士mettler toledo公司）；B50C多功能食品攪拌機(jī)（北京永興食品機(jī)械公司）；wizord2.0真空冷凍干燥系統(tǒng)（美國SP scientific公司）；GM 300刀式均質(zhì)粉碎儀（德國Retsch公司）；v100高效混合機(jī)（廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司）；800/2s深凹型雙室真空包裝機(jī)（諸城市匯品機(jī)械有限公司）；FSH-2高速勻漿機(jī)（上海汗諾儀器有限公司）；Vortex-Genie2漩渦混合器（美國Scientific Industries公司）；LYNX4000離心機(jī)（美國Thermo公司）；LCMS-8045液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 基質(zhì)樣品研制

將20 kg不含磺胺類藥物的雞肉放入斬拌機(jī)并將其打碎成肉泥，分別稱取計算好的各磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解后緩慢滴加到雞肉泥中，使用多功能食品攪拌機(jī)進(jìn)行攪拌，攪拌時間為2 h，使其充分混勻，使用真空冷凍干燥機(jī)制成雞肉凍干粉中磺胺藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，具體流程見圖1。

圖1 樣品制備流程圖

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中磺胺類藥物檢測

1.2.2.1 樣品處理

提取。稱取1 g（精確至0.01 g）凍干粉樣品，加8 mL Mcllvaine Na2EDTA緩沖液，渦旋1 min，超聲20 min，在-2 ℃，10 000 r/min離心5 min，收集上清液。殘渣中加8 min磷酸鹽緩沖液，重復(fù)提取1次，合并提取液，混勻，備用。

凈化。固相萃取柱依次使用甲醇和水活化，取備用液過柱，依次用水5 mL和20%甲醇水溶液淋洗，抽干，用洗脫液10 mL洗脫。收集洗脫液，于40 ℃水浴氮吹至近干，用初始流動相復(fù)溶，渦旋溶解后過濾膜備用。

1.2.2.2 儀器工作條件

1.2.2.2.1 液相色譜條件

色譜柱C18（150 mm×2.1 mm×1.7 m）；柱溫35℃；進(jìn)樣量10 μL；流速0.3 mL/min；流動相A相為甲醇-乙腈（2∶8，含0.1%甲酸，體積比），B相為0.1%甲酸水溶液。

洗脫梯度（0～5 min，90% B相至10% B相；5～10 min，10% B相至70% B相，10～12 min，70% B相至40% B相；12～13 min，40% B相至0 B相；13～14 min，0B相至90% B相）。

1.2.2.2.2 質(zhì)譜條件及參數(shù)

電噴霧離子源（electrosprayionization，ESI）；多反應(yīng)監(jiān)測（multi-reactionmonitoring，MRM）模式；正離子模式；霧化器流量3 L/min；干燥器流量10 L/min；加熱器流量10 L/min；接口溫度300 ℃；接口電壓4.0 kV；其他質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 磺胺甲基嘧啶與磺胺二甲基嘧啶的質(zhì)譜分析條件參數(shù)

1.2.3 均勻性和穩(wěn)定性試驗

1.2.3.1 均勻性檢驗

參考GB/T 15000.3—2008《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則（3）標(biāo)準(zhǔn)樣品 定值的一般原則和統(tǒng)計方法》[13]，從制備的樣品中隨機(jī)抽取10袋，每袋重復(fù)測定3次，分析樣品中磺胺類藥物含量。所有樣品以隨機(jī)次序在重復(fù)性條件下測試，選擇不低于定值方法精密度和靈敏度的測量方法，按照上述檢測方法對樣品進(jìn)行均勻性檢測，檢測數(shù)據(jù)用單因素方差分析法來判斷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是否均勻[13]。

1.2.3.2 穩(wěn)定性檢驗

依據(jù)GB/T 15000.3—2008[13]的規(guī)定，采用不同溫度的方式，模擬檢測樣品運(yùn)輸過程中的短期穩(wěn)定性，采用不同時間間隔的方式，模擬檢測樣品儲存過程中的長期穩(wěn)定性。

短期穩(wěn)定性：樣品在原本正常儲存溫度下放置72 h后，選擇10，20，40和60 ℃共4個溫度點(diǎn)，模擬運(yùn)輸中遇到的極端溫度，采用隨機(jī)抽樣方式每個取樣點(diǎn)均設(shè)置3個樣品，平行測定2次，進(jìn)行樣品的短期穩(wěn)定性分析[14]。

長期穩(wěn)定性：在室溫下，選擇0，1，3，5，7，9和12月共7個取樣時間點(diǎn)，采用隨機(jī)抽樣方式每個取樣點(diǎn)均設(shè)置3個樣品，平行測定2次，進(jìn)行樣品的長期穩(wěn)定性分析。

式（1）～（4）依次分別表示為：穩(wěn)定性評估基本模型；回歸方程斜率計算方法；回歸方程截距計算方法；標(biāo)準(zhǔn)偏差s（β1）計算方法，其中s表示直線上每個點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，計算見式（5）。

式中：X為測量的時間；Y為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值；Xi為每次測量的時間；Yi為每次測量時標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值；X為測量時間的平均值；Y為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性值的平均值；β0為回歸方程的截距；β1為回歸方程的斜率；n為測量次數(shù)；s(β1)為n次測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差；s為直線上每點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.4 基質(zhì)樣品定值

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值依據(jù)GB/T 15000.3—2008[13]的規(guī)定，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值采取6家實驗室聯(lián)合測定的方法，每家發(fā)2個樣品，每個樣品測3次，出具6個數(shù)據(jù)，各實驗室均按照GB/T 20759—2006《畜禽肉中十六種磺胺類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[15]或GB/T 21316—2007《動物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[16]進(jìn)行檢測。分別使用夏皮洛-威爾克（Shapiro-Wilk）法、科克倫（Cochran）法、狄克遜（Dixon）法檢驗各實驗室的組內(nèi)數(shù)據(jù)是否為正態(tài)分布、各實驗室間的數(shù)據(jù)是否等精度、各實驗室間的數(shù)據(jù)是否有離群值，在滿足上述條件的情況下對各實驗室組間的數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗。對滿足所有條件的實驗室數(shù)據(jù)進(jìn)行平均值計算，結(jié)果即為該樣品定值結(jié)果[13-14]。

依據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，試驗中不確定度包括均勻性引入的不確定度、穩(wěn)定性引入的不確定度、定值引入的不確定度。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞肉中磺胺類藥物基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖

運(yùn)用儀器檢測方法對制備的磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行測試，磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶純標(biāo)準(zhǔn)品及試驗制備的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)譜圖見圖2和圖3。磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶色譜圖峰形尖銳對稱，保留時間附近未出現(xiàn)干擾峰，基線平穩(wěn)，表明定量數(shù)據(jù)具有一定準(zhǔn)確性。二級質(zhì)譜圖中的碎片離子的質(zhì)荷比與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所產(chǎn)生的碎片離子偏差小，表明能準(zhǔn)確定性基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中含有磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶。

圖2 純標(biāo)準(zhǔn)品和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中磺胺甲基嘧啶的儀器檢測結(jié)果圖

圖3 純標(biāo)準(zhǔn)品和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中磺胺二甲基嘧啶的儀器檢測結(jié)果圖

2.2 均勻性檢驗結(jié)果

均勻性檢測結(jié)果詳見表2和表3。

表2 樣品中磺胺甲基嘧啶項目均勻性檢測結(jié)果單位：μg/kg

表3 樣品中磺胺二甲基嘧啶項目均勻性檢測結(jié)果單位：μg/kg

2.3 穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

2.3.1 短期穩(wěn)定性

短期穩(wěn)定性檢測結(jié)果詳見表4和表5。

表4 樣品中磺胺甲基嘧啶項目短期穩(wěn)定性測試結(jié)果 單位：μg/kg

表5 樣品中磺胺二甲基嘧啶項目短期穩(wěn)定性測試結(jié)果 單位：μg/kg

2.3.2 長期穩(wěn)定性

長期穩(wěn)定性檢測結(jié)果詳見表6和表7，長期穩(wěn)定趨勢圖見圖4。

圖4 磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶長期穩(wěn)定趨勢圖

表6 樣品中磺胺甲基嘧啶項目長期穩(wěn)定性測試結(jié)果 單位：μg/kg

表7 樣品中磺胺二甲基嘧啶項目長期穩(wěn)定性測試結(jié)果 單位：μg/kg

2.4 定值結(jié)果

雞肉凍干粉中磺胺類獸藥殘留基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)6家實驗室定值結(jié)果詳見表8和表9。

表8 各定值實驗室檢測雞肉凍干粉中磺胺甲基嘧啶的測試結(jié)果

表9 各定值實驗室檢測雞肉凍干粉中磺胺二甲基嘧啶的測試結(jié)果

對各實驗室數(shù)據(jù)進(jìn)行Shapiro-Wilk法檢驗，經(jīng)計算各實驗室W＞W(wǎng)(6,0.95)，表示在顯著性水平α=0.05上符合正態(tài)分布；對各實驗室數(shù)據(jù)平均值用Cochran法檢驗，經(jīng)計算C＜C(0.05,6,6)，表示各實驗室間的測量屬于等精度測量；對各平均值數(shù)據(jù)用Dixon法檢測，經(jīng)計算滿足r1＜f(0.05,6)且rn＜f(0.05,6)，表示各實驗室間的測量無顯著性差異。

對各實驗室數(shù)據(jù)進(jìn)行Shapiro-Wilk法檢驗，經(jīng)計算各實驗室W＞W(wǎng)(6,0.95)，表示在顯著性水平α=0.05上符合正態(tài)分布；對各實驗室數(shù)據(jù)平均值用Cochran法檢驗，經(jīng)計算C＜C(0.05,6,6)，表示各實驗室間的測量屬于等精度測量；對各平均值數(shù)據(jù)用Dixon法檢測，經(jīng)計算滿足r1＜f(0.05,6)且rn＜f(0.05,6)，表示各實驗室間的測量無顯著性差異。

2.5 不確定度

試驗中不確定度包括均勻性引入的不確定度、穩(wěn)定性引入的不確定度、定值引入的不確定度，計算詳見式（6）～（8），再計算出標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，計算詳見式（9）。

式中：MSamong為樣品間均方；MSwithin為樣品內(nèi)均方；n為測量次數(shù)；s(β1)為穩(wěn)定性測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差；t為穩(wěn)定性測量的時間；s為定值結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

經(jīng)計算，研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各項不確定度及定值結(jié)果詳見表10和表11。

表10 雞肉凍干粉中磺胺甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各項不確定度及定值結(jié)果 單位：μg/kg

表11 雞肉凍干粉中磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各項不確定度及定值結(jié)果 單位：μg/kg

3 結(jié)論

通過對相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的學(xué)習(xí)與研究，制備雞肉凍干粉中磺胺類獸藥殘留基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將雞肉通過打碎、加標(biāo)、凍干等一系列制備步驟后制得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，經(jīng)過均勻性及穩(wěn)定性檢驗后，判斷結(jié)果是否滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，通過6家實驗室聯(lián)合定值的方式對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值和不確定度評估，結(jié)果滿足動物源性食品中獸藥殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于實驗室內(nèi)考察檢測儀器、檢測方法及人員能力，對于提高基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的測量準(zhǔn)確度和我國獸藥殘留檢測技術(shù)的提升有著重要意義。