三個產地丁香花蕾油的水蒸氣蒸餾法提取及成分分析

尹團章 ，邵佩 ，吳昭 ，邵興偉 ，張磊 ，蹇順華 *

1. 湖北中煙工業有限責任公司（武漢 430040）；2. 武漢黃鶴樓新材料科技開發有限公司（武漢 430040）；3. 武漢黃鶴樓香精香料有限公司（武漢 430040）

丁香（Eugenia caryophyllataThunb.）為桃金娘科（Myrtaceae）植物，廣泛種植于馬來群島、非洲，主產于馬來西亞、印度尼西亞、坦桑尼亞、馬達加斯加等地。此外，中國也是丁香屬的自然分布中心，我國廣東、廣西、海南等地栽培較多[1]。

丁香花蕾為干燥花蕾，味辛、溫，藥用價值高，具有溫中降逆、暖腎助陽、行氣止痛、醒神開竅、辟邪殺蟲等功效[2]。同時也具有食用性，可作辛香料的主配料[3]。其主要提取物丁香花蕾油，作為一種名貴香料，在食品[4-5]、日化[6-7]和醫藥[8-9]等行業中使用廣泛，具有良好的市場應用前景。

目前丁香花蕾油的研究多集中于抑菌抗氧化功效[10-11]和香氣成分分析[12-16]，關于不同產地丁香花蕾油及其制備方法等的文獻報道較少。在丁香花蕾油的提取方法的報道上，主要有水蒸氣蒸餾法[13]和超臨界CO2萃取法[14,16]。超臨界CO2萃取設備作為一種精油提取設備，價格較昂貴，控溫穩定性有待提高，并且超聲過程噪音大，生產普遍性和適用性不強[17]。而水蒸氣蒸餾法工藝中，丁香花蕾油易與水形成乳化液，在油水分離器中不易分離，收集的油水混合物較少，導致得油率較低，但其操作簡單、成本低、適合工業化生產，因此需進行工藝的改良以提高得率。在關于丁香花蕾油的香氣成分分析的文獻中，除了主要成分丁香酚、β-石竹烯和乙酸丁香酚酯外，其他揮發性成分的分析和鑒定還有待進一步深入研究[12-16,18]。周葉燕等[13]根據丁香的年出產量開展了印度尼西亞、馬達加斯加、越南等原料產地的丁香花蕾油提取得率的研究，但我國和國外主產區丁香花蕾油相比較的相關研究較少，因此研究根據我國和國外丁香的主產區開展中國廣東、馬來西亞和坦桑尼亞三個產地丁香花蕾油的研究，采用水蒸氣蒸餾法的改良工藝提取丁香花蕾油，并結合氣相色譜-質譜聯用技術對三個產地的丁香花蕾油的香氣成分進行分析和鑒定，以期為丁香花蕾油精細加工提供理論依據，也旨在為我國食品、香精香料行業的辛香類產品開發提供一些值得借鑒的信息。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

丁香花蕾：干燥花蕾，含水率＜8%，產地分別為馬來西亞、坦桑尼亞和中國廣東，來自供應商供應的商品；無水硫酸鈉、無水乙醇，分析純。

1.2 儀器和設備

8890-5977B型氣相色譜-質譜聯用儀（美國安捷倫公司）；98-1-B型電子調溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；milli-Q lntegral 3型超純水儀[美國密理博（Milipore）公司]；5 000 mL圓底燒瓶、冷凝管、三通彎角、1 000 mL磨口三角錐形瓶、分液漏斗等實驗室常規玻璃儀器（四川蜀牛玻璃儀器有限公司）。

1.3 試驗與方法

1.3.1 丁香花蕾油的制備方法

水蒸氣蒸餾法改良工藝提取裝置見圖1。

圖1 丁香花蕾油的制備裝置圖

具體步驟：（1）提取：稱取0.5 kg丁香花蕾加入5 000 mL圓底燒瓶2中，以1∶8（g/mL）料液比加入超純水，置于電熱套1中，開始加熱，溫度設置為100℃，大約40 min后，開始有油水混合蒸氣通過三通彎角3進入水平冷凝管5，冷凝液滴落進三角錐形瓶；（2）收集：當冷凝液裝滿三角錐形瓶7后，將油水混合液（乳化液，乳白色）轉移至燒杯中，整個過程重復3～4次；（3）破乳：提取5 h后，結束提取試驗，采用低溫冷凍或添加超純水方法進行破乳，實現油水分離和分層，靜置0.5～1 h；（4）分離：將分層的油水置于分液漏斗中，分離，得到丁香花蕾油粗油；（5）脫水干燥：將丁香花蕾油粗油再按2∶1質量比加入無水硫酸鈉室溫下干燥后4～6 h，得到澄清透明的丁香花蕾油。

1.3.2 破乳時間的測定

將一定質量的丁香花蕾油和水的乳化液，分別按照冷凍（4 ℃冷藏）和添加3倍質量超純水兩種方法進行破乳，直至油和水完全分離，計算和統計破乳時間，以小時（h）為單位，重復3次。

1.3.3 丁香花蕾油的得率和收集率

丁香花蕾油的得率按式（1）計算[19]。

式中：R1為丁香花蕾油的得率，%；m1為丁香花蕾油質量，g；m2為丁香花蕾的質量，g。

丁香花蕾油的收集率按式（2）計算

式中：R2為丁香花蕾油的收集率，%；R1為丁香花蕾油的得率，%；21%為丁香花蕾油的理論最高含油量，丁香花蕾油的理論含油量為10%～21%[16]。

1.3.4 丁香花蕾油GC-MS 分析條件

1.3.4.1 氣相色譜條件

色譜柱：DB-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫：50 ℃保持2 min，以8 ℃/min的速率升至280 ℃，保持25 min；進樣口溫度：250℃；恒流進樣，載氣（He）流量為1 mL/min；分流比1∶10，傳輸線溫度280 ℃。

1.3.4.2 質譜條件

EI離子源；電子能量70 eV；掃描范圍33～400 amu；四級桿溫度：150 ℃；離子源溫度280 ℃。

1.3.5 丁香花蕾油的定性定量方法

以美國國家標準技術研究所譜庫NIST17.L檢索為主，同時結合人工解析質譜圖[20]對各個組分進行定性；采用峰面積歸一化法對各個組分進行定量，計算各個不同揮發性化學組分的相對含量。

1.4 數據處理

采用Microsoft Office Excel 2010對試驗數據進行統計分析，采用Origin 8.0軟件進行繪圖，圖表中數據以平均值±標準差的形式表示。

2 結果與討論

2.1 三個產地丁香花蕾油的得率

通過水蒸氣蒸餾法的改良工藝，成功制備得到丁香花蕾油，試驗得油率從改進前工藝（傳統水蒸氣蒸餾的油水分離器）的不足1%（數據未提供）顯著提高到12%以上（見圖2），其關鍵在于改良工藝中油水混合物的有效收集和破乳二個步驟。從圖2可知，這三個產地的丁香花蕾油的得率存在顯著性差異（P＜0.05），得率大小排序為中國廣東＞坦桑尼亞＞馬來西亞，得率符合以赤道為中心向兩極遞增的規律，這也與周葉燕等[13]的研究結果基本一致。

圖2 三個產地丁香花蕾油的得率

2.2 丁香花蕾油的有效收集

根據文章方法中的1.3.3小節計算可知，常規水蒸氣蒸餾法工藝的丁香花蕾油的收集率僅在4.2%左右，而改良工藝的丁香花蕾油的收集率在60%以上（見圖3），遠遠高于常規水蒸氣蒸餾法工藝的收集率。這是因為在常規水蒸氣蒸餾法丁香花蕾油提取中實際的難點在于精油和水容易形成乳化液難以分離，在玻璃材質的油水分離器中不能即時分層得到精油，因此油水分離器并不適用于丁香花蕾油的提取。

圖3 兩種工藝中丁香花蕾油的收集率

在常規水蒸氣蒸餾法工藝的油水分離器中，丁香花蕾油不能在此實現油水的即時分離（一步），而且油水分離器中的集油管容量（5 mL）有限，油水混合物反復回流、蒸發、冷凝，不能將油水混合物全部收集，最終得油率較低。在改良工藝中，針對常規水蒸氣蒸餾法工藝油水不能即時分離這一現狀進行有效的提取裝置改進（見圖1），不使用油水分離器進行精油的分離和收集，先通過水平冷凝管將油水混合物冷凝為液滴后收集到三角瓶中（第一步），這樣的益處是能將丁香花蕾油最大化地收集起來，再結合后續的破乳步驟實現油水分離和分層（第二步），能提升丁香花蕾油的得油率。通過常規水蒸氣蒸餾法工藝（一步法，油水收集和分離同時進行）改為改良工藝（二步法，先收集再分離），能最大限度地收集丁香花蕾精油，最終提升精油得率。

2.3 破乳工藝步驟的確立

在改良工藝中，在前期的油水混合液（乳化液）的有效收集的基礎上，開展油水乳化液的破乳，實現油水分離分層。在丁香花蕾油和水乳化液的分離中，周葉燕等[13]采用2% NaCl鹽析方法分離油水混合物，也是一種破乳方法。破乳這一工藝步驟打破了丁香花蕾油油水乳化液中的分子間平衡，使精油從水分子間分離出來，最后達到油和水的分層。

試驗在探索丁香花蕾油水乳化液的多種破乳方法中，根據無添加外源物以及經濟、簡單易行的原則確立了冷凍破乳和添加超純水破乳兩個方法。通過試驗結果可知，冷凍方法破乳時間為12 h，而添加超純水方法破乳時間僅為0.5 h（見圖4）。添加超純水破乳的方法的時間更短，效率更高。另外，超純水選材容易，無環境壓力，因此選擇添加超純水破乳的方法進行丁香花蕾油油水混合液的分離。

圖4 不同破乳方法的破乳時間

2.4 丁香花蕾油揮發性成分的GC-MS分析結果

用裝有DB-5MS型色譜柱的GC-MS聯用儀分別對三個產地的丁香花蕾油的揮發性成分進行分析和鑒定，所得對應的總離子流圖見圖5，鑒定出的揮發性成分見表1。

圖5 三個產地丁香花蕾油的TIC總離子流圖

表1 三個產地丁香花蕾油中揮發性成分的鑒定結果

接表1

由圖5和表1可以看出：采用水蒸氣蒸餾法結合氣質聯用儀分別萃取和分析三個產地丁香花蕾中的香氣成分，共檢測出34種揮發性成分；共有揮發性成分18種（烯烴類7種、酯類3種、酚類3種、醇類3種、烷類1種、其他類1種）。

三個產地丁香花蕾油中檢測出的揮發性成分的種類多少，也和它們精油得率的規律基本一致，符合以赤道為中心向兩極遞增的規律，中國廣東產地的丁香花蕾油的揮發性成分種類最多，共檢測出33種；坦桑尼亞產地的丁香花蕾油的揮發性成分，共檢測出28種；馬來西亞產地的丁香花蕾油的揮發性成分，共檢測出23種，三個產地丁香花蕾油中的揮發性成分種類數存在差異。

研究表明：丁香酚、β-石竹烯和乙酸丁香酚酯是丁香花蕾油中的主要香氣成分，研究中這3種物質在三個產地的丁香花蕾油中的占比較高，均達到總揮發性成分的95%以上，其中中國廣東產地的比例為95.35%，馬來西亞產地的比例為96.63%，坦桑尼亞產地的比例為95.99%。

丁香花蕾油中除了丁香酚、β-石竹烯和乙酸丁香酚酯這3個主要香氣成分外，還含有一種重要的香氣成分葎草烯，又稱為α-石竹烯，是β-石竹烯的同分異構體，它具有似丁香油的辛香和木香香氣，其相對含量在1%左右，占第四位。同時，在丁香花蕾油中存在（-）-異丁香烯（Bicyclo[7.2.0]undec-4-ene，4, 11, 11-trimethyl-8-methylene-，[ 1R-（1R*，4Z，9S*）]-）、異丁香烯同分異構體4, 11, 11-三甲基-8-亞甲基雙環[7.2.0]十一碳-3-烯（4, 11, 11-trimethyl-8-methylene-bicyclo[7.2.0]undec-3-ene）、蘇合香烯等成分，屬首次報道。異丁香酚[Phenol，2-methoxy-4-（1-propenyl）]（丁香酚的同分異構體），具有清甜的辛香，有香石竹、丁香花、香羅蘭樣花香，又有似龍涎香、麝香、豆香與膏香氣息，可用于轉化為香蘭素[21]，還具有體內外抗炎的作用[22]。另外，石竹烯醇，一種倍半萜醇，有木香香氣[23]；葎草烯醇-II，石竹烯氧化物，屬于β-石竹烯的衍生物，具有辛香和木香香氣。這些丁香酚、β-石竹烯的同分異構體、衍生物的作用，使得丁香花蕾油具有典型的辛香為主和兼具木香的香韻。

古巴烯、γ-依蘭油烯、α-法尼烯、γ-欖香烯、α-芹子烯，這些萜烯類物質的存在，豐富和飽滿了丁香花蕾油的香韻，符合丁香花蕾油的文獻的研究報道[18]，不僅提供了丁香花蕾油抗氧化、抗菌的特性，還可為作為其他食用香精的配料提供參考。

3 結論

用水蒸氣蒸餾法的改良工藝制備的三個產地丁香花蕾油，能有效收集油水混合物和通過破乳方法實現精油與水完全分離，最終提高得油率。三個產地丁香花蕾的得油率，隨地理緯度的增加而升高，分別為中國廣東14.12%、坦桑尼亞13.43%、馬來西亞12.56%。同時，三個產地丁香花蕾油的揮發性成分數量也呈現出隨地理緯度的增加而增多的趨勢。

通過GC-MS成分分析，三個產地的丁香花蕾油在主要成分含量和香氣成分上也有一定差別，可以得出：（1）三個產地的丁香花蕾油中，總共檢測鑒定出34種揮發性成分，其中共有揮發性成分18種；（2）丁香酚、β-石竹烯和乙酸丁香酚酯這三種主要香氣成分均占三個產地丁香花蕾油中的總揮發性成分的95%以上，對丁香花蕾油的特征香氣起主導作用；（3）在三個產地的丁香花蕾油中均包含葎草烯，這也是一種重要香氣成分；（4）異丁香酚、（-）-異丁香烯、異丁香烯同分異構體（4, 11, 11-三甲基-8-亞甲基雙環[7.2.0]十一碳-3-烯）等成分存在于丁香花蕾油中，豐富了丁香花蕾油的組分；（5）丁香酚、β-石竹烯的同分異構體也存在于丁香花蕾油中，符合同分子組成結構具有多態性的規律。

通過三個產地丁香花蕾油的得率和GC-MS成分分析，對指導不同產地丁香花蕾原料和精油的采購價格、丁香花蕾油的精細加工、丁香花蕾油辛香香韻強度的合理使用具有一定的參考意義。