一株產藍色素微生物的篩選鑒定及色素性質分析

衡好，王堯，程佳怡，劉行準，楊怡，郭靜靜

南京師范大學中北學院環境生物技術研究中心（丹陽 212300）

色素具有極高的應用價值，在醫藥、化妝品、科研染料、輕紡印染及食品等領域中均具有廣泛的應用前景。天然色素是以植物、動物及微生物等為原料，采用合適的方法可提取生物體內細胞產生的色素。植物體的生長受氣候、溫度等外界條件的限制較大。動物體繁殖周期長、細胞培養條件相對苛刻，與二者相比，微生物具有種類繁多、生長繁殖速度快、培養工藝簡單等優點，因此是天然色素來源的首要選擇[1]。

隨著生活質量的提高，食品安全越來越受到重視，同時食品的顏色對消費者吸引也起著重要作用[2]。人工合成的色素工藝條件復雜、成本高、對生物毒性大，甚至有致癌風險，而天然色素無論是安全性還是色澤方面均存在著突出的優越性。在食品工業中，天然色素常被用作著色劑和抗氧化劑等[3]。同時，許多天然色素具有良好的藥用價值，如姜黃素具有抗腫瘤、抗纖維化、腎臟保護、防治肥胖和抗炎等作用[4]。

藍色素作為三原色之一，應用潛力巨大，然而其來源非常有限。已報道，天然藍色素多由植物中提取，產藍色素的微生物多局限在假單胞菌、放線菌、鏈霉菌及Janthinbacterium屬菌，其中在鏈霉菌中報道最多[5-7]。因此，新型產藍色素菌株的開發顯得十分重要。

試驗從江蘇省鎮江丹陽市的土壤中分離篩選獲得一株產藍色素的微生物，對其分子生物學鑒定及菌落形態的觀察，并對色素的性質進行初步探究，以期為該菌株的利用奠定基礎及為產天然色素的新型菌株開發拓寬領域。

1 材料與方法

1.1 土樣

采自江蘇省鎮江市丹陽市。

1.2 培養基

LB培養基（液體，pH 7.5）：胰蛋白胨10.0 g/L、酵母粉5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L。固體培養基加入2%瓊脂粉。

高氏1號培養基（液體，pH 7.5）：可溶性淀粉20 g/L，NaCl 0.5 g/L，KNO31.0 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L。固體培養基加入2%瓊脂粉。

以上培養基均需115 ℃滅菌20 min。

1.3 試驗儀器與設備

電子天平（ALC-1100.2，Sarforius）；恒溫培養箱（DNP-9272，上海精宏）；超凈工作臺（CA-1390，江蘇太倉）；pH計（SevenEasy S20，梅特勒）；臺式離心機（5145D，Eppendorf）；高壓滅菌鍋（ES-315，Tomy）；光學顯微鏡（Motic）。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌株的篩選

稱取2 g土壤溶于18 mL滅菌的無菌水中，振蕩混勻后靜止30 min，取上清液稀釋至10-4，取100 μL稀釋液涂布于高氏1號固體培養基上，放于30 ℃培養箱中培養5 d，挑取產藍色素的菌體采用四區劃線的方法分離單菌落，命名為DY-1，用高氏1號液體培養基培養至對數生長期后用50%的甘油保存菌種。

1.4.2 形態學觀察與革蘭染色

對固體培養基上長出來的菌體觀察形態特征，高氏1號液體培養基長出的菌體用革蘭染色，在光學顯微鏡下觀察結果。

1.4.3 分子生物學鑒定

采用試劑盒獲得菌株的基因組DNA，以基因組DNA為模板經擴增獲得該菌株16S rRNA，送南京秉達生物科技有限公司測序。將測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST比對分析，采用MEGA軟件構建系統進化樹。

1.4.4 色素性質的探究

采用王海勝等[8]研究中報道的方法提取色素，進行色素性質的分析。

1.4.4.1 色素的溶解性測定

取500 mg色素粗提物，分別放置于2 mL無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、去離子水中，混合均勻，觀察顏色的變化并根據最大吸收波長下的吸光度判定其溶解性。

1.4.4.2 色素吸光譜的測定

取5 g藍色素的粗提物溶解在100 mL乙醇中，制得乙醇色素溶解液。利用分光光度計在190～480 nm處作大范圍波長掃描，并記錄其吸光度。

1.4.4.3 溫度對色素穩定性的影響

取等體積的乙醇色素溶解液分別置于20，30，40和50 ℃的恒溫水浴鍋中2，4，6和8 h，測定其吸光度。

1.4.4.4 pH對色素穩定性的影響

取5 mL乙醇色素溶解液，分別用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液調節至pH 5，6，7，8和9，混合均勻后靜止2，4，6和8 h，測定吸光度。

1.4.4.5 金屬離子對色素穩定性的影響

分別配制濃度為100 mmol/L的Mn2+、Mg2+、Co2+、Cu2+離子溶液，取1 mL加入9 mL乙醇色素溶解液中，混合均勻，測定0 h和放置2，4和6 h后的吸光度。

1.4.4.6 光照對色素穩定性的影響

取1 mL乙醇色素溶解液在白光下分別放置0，2，4和6 h，測定其吸光度。

1.4.5 抑菌性研究

選取大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌做抑菌性試驗。每組取3片浸入乙醇色素提取液的直徑9 mm的小濾紙片，分別置于3種菌的涂布平板上，并各放置1個浸入無水乙醇的濾紙片進行對照，在30 ℃培養24 h后觀察是否有抑菌現象。

2 結果與分析

2.1 形態學特征及革蘭染色結果

菌體與培養基結合較緊密，菌落凸起、邊緣整齊、表面黏稠，藍色素主要在菌落的上部，菌落背面呈乳白色（菌體形態特征見圖1）。100倍物鏡下觀察到藍色素呈現一種菱形結構（圖2），革蘭染色顯示該菌株呈陰性（圖3）。

圖1 DY-1菌體形態

圖2 藍色素的顯微形態

圖3 DY-1革蘭染色

2.2 菌株的分子生物學鑒定

16S rRNA測序結果經BLAST比對發現，其與Duganella pernnlastrain FT109W和Duganella margaritaFT134W序列相似度最高，親緣關系最近，初步判斷該菌株為杜檊氏菌屬。

圖4 DY-1系統進化樹

2.3 色素性質的分析

2.3.1 藍色素溶解度測定

將藍色素樣品分別加入不同的溶液中，發現樣品易溶于無水乙醇，微溶于去離子水，不溶于丙酮、乙酸乙酯、甲醇。

2.3.2 藍色素吸光譜的測定

如圖5所示，紫外可見光吸收光譜顯示該藍色素乙醇溶液在220 nm處具有最高吸收峰。

圖5 藍色素乙醇溶液190～480 nm吸收光譜圖

2.3.3 溫度對藍色素性質的影響

將藍色素乙醇溶液分別在4個不同溫度下避光保存2，4，6和8 h，測定波長220 nm處的吸光度。結果顯示（圖6），在20 ℃和30 ℃下，放置一段時間后，吸光度變化不明顯，表明該藍色素在20 ℃和30 ℃下具有一定穩定性。而在40 ℃和50 ℃下，吸光度隨時間增長而均有增加，其中50 ℃增加較明顯，由0 h的吸光度0.228增加至0.290，推測高溫可能存在一定的增色效果。

圖6 溫度對藍色素穩定性的影響

2.3.4 光照對藍色素穩定性的影響

如圖7所示，與0 h相比強光照射2，4和6 h后，色素殘存率分別為91.8%，85.7%和78.6%，表明該色素對強光較敏感，宜黑暗保存。

圖7 光照對藍色素穩定性的影響

2.3.5 pH對藍色素穩定性的影響

如圖8所示，同一時間段，酸性或者堿性條件下藍色素乙醇溶液在220 nm的吸光度與pH 7相比均有明顯增高，說明酸和堿對藍色素有增色效果。另外，放置4 h之后，在pH 5條件下藍色素吸光度趨于平穩，而在pH 6，8和9的條件下，藍色素吸光度均隨時間延長下降明顯，表明在這些條件下長時間放置會使酸堿的增色效應有所下降。

圖8 pH對藍色素穩定性的影響

2.3.6 金屬離子對藍色素穩定性的影響

如圖9所示，Mn2+對藍色素增色效果顯著，6 h增色效果達到204%。Mg2+則有削減吸光度的現象，4 h由0.282降至0.156，降幅達到55.3%，之后趨于平穩。Co2+和Cu2+對藍色素在短時間內（2 h）有增色效應，但隨著放置時間的延長，增色效果減弱。

圖9 金屬離子對藍色素穩定性的影響

2.4 藍色素抑菌性鑒定

1，2和3號平板分別涂布大腸桿菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌，標有“d”的濾紙片為乙醇對照組，其余為藍色素乙醇溶液試驗組。由圖10可知，3個不同菌株的平板上均沒有出現抑菌圈，表明該藍色素對3種菌的生長均沒有抑制效果。

圖10 抑菌試驗

3 結論

在高氏一號培養基上篩選獲得一株產藍色素的微生物，經16S rRNA測序結果，BLAST比對及系統進化的構建，判定該微生物為杜檊氏菌屬。進一步對色素進行提取，結果表明該藍色素易溶于無水乙醇，最大吸收波長在220 nm。強光、強酸和強堿對色素穩定性影響較大，20 ℃或30 ℃下儲存有利于藍色素的穩定。Mn2+對藍色素具有明顯的增色效應，Co2+和Cu2+對藍色素的影響較小。該色素對大腸桿菌、酵母菌及枯草芽孢桿菌均沒有抑制現象。