氨糖軟骨素鈣姜黃復合物對骨密度的協同作用

何晶，邱春媚，黃遠英，殷光玲，張旭光

湯臣倍健股份有限公司（廣州 510663）

近年來，骨質疏松癥發病率逐年增長，作為重大疾病深受關注和討論[1]。以骨密度為關鍵詞檢索，截至2022年8月，關于骨密度的注冊保健食品有700余例，這些保健食品的主要功能成分為氨基葡萄糖、硫酸軟骨素、鈣等。補鈣是治療及預防骨質疏松的重要方式[2-3]。氨基葡萄糖可以促進軟骨合成與軟骨細胞生長，增加骨骼鈣質攝取量，刺激黏多糖生化合成，增強滑膜液黏度，減輕患者疼痛[4-6]。硫酸軟骨素可以逆轉軟骨損壞，增加關節滑液。軟骨素通過對環氧化酶-2進行抑制，減輕關節的發炎情況；減少纖維蛋白血栓的形成，促進軟骨下骨血循環[6]。軟骨素與氨基葡萄糖協同作用，進一步提高改善效果，并且聯合使用安全性加高，不會增加不良反應，兩者的聯合使用在骨關節產品中較為常見[5,7]。姜黃在我國傳統醫學中，具有悠久的使用歷史[8]，其具有廣泛的抗腫瘤、抗炎、抗氧化、清除自由基等作用。研究表明，姜黃對骨質疏松有一定治療作用，主要是抗炎機制，以及對酶類，NF-κB、OPG/RANKL、FoxO3a/Wnt、Wnt/β-catenin、TGF-β/Smad2/3等信號通路的調控[9-11]。

通過研究一種氨糖軟骨素鈣姜黃復合物對骨質疏松模型大鼠的骨密度的影響，探究氨糖、軟骨素、鈣及姜黃在增加骨密度方面的協同作用，并對其安全性進行評估，為骨關節產品的研究與開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品

樣品為棕黃色片劑，人體推薦攝入量4.14 g/d，按體重折合劑量0.069 g/（kg·bw）。樣品中功效成分添加量約為氨基葡糖硫酸鉀鹽1 500 mg，硫酸軟骨素500 mg，鈣160 mg，姜黃素40 mg，其余為輔料用于片劑成型。樣品粉碎后進行試驗。

1.1.2 試驗動物

骨密度試驗：SPF級雌性SD大鼠（來源）。安全毒理試驗：SPF級昆明種小鼠，SD大鼠（來源）。

1.1.3 儀器與設備

contrAA700連續光源原子吸收光譜儀（德國Analytik Jena）；HOLOGIC雙X線骨密度儀（美國HOLOGIC）；AU680全自動生化分析儀（美國BECKMAN COULTER）。

1.2 試驗方法

1.2.1 骨密度試驗

1.2.1.1 卵巢切除

大鼠以30 mg/（kg·bw）的劑量注射戊巴比妥鈉溶液，麻醉，切除雙側卵巢，術后注射青霉素。假手術組切除約0.5 g脂肪，保留雙側卵巢。卵巢切除后5 d，進行陰道涂片檢查。

1.2.1.2 受試物給予

試驗動物按體重隨機分組：假手術組、卵巢切除+溶劑對照組、卵巢切除+碳酸鈣對照組、卵巢切除+樣品低劑量組[0.345 g/（kg·bw）]、卵巢切除+樣品中劑量組[0.690 g/（kg·bw）]、卵巢切除+樣品高劑量組[2.070 g/（kg·bw）]。假手術組和卵巢切除+溶劑組給予等體積的1%羧甲基纖維素，卵巢切除+碳酸鈣對照組經口給予與樣品高劑量組相同鈣含量的碳酸鈣。自試驗開始，灌胃對應的受試液，試驗時間為90 d。

1.2.1.3 動物生長發育指標

每周稱量動物體重。

1.2.1.4 股骨骨密度及骨鈣含量的測定

試驗結束后，處死動物，剝離股骨，烘烤至恒重，檢測股骨中點處、遠心端的骨密度。

稱量股骨的總質量后，檢測骨鈣含量。

1.2.2 安全毒理試驗

1.2.2.1 小鼠急性毒性試驗

采用最大耐受劑量法，選用20只試驗小鼠，雌雄各半。每日經口灌胃2次（間隔4 h），每次0.2 mL/（10 g·bw），累積達20.00 g/（kg·bw）。初次灌胃前禁食16 h，灌胃后觀察2周，記錄試驗動物狀態。

1.2.2.2 Ames試驗

試驗采用鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型TA97a，TA98，TA100，TA102菌株，以多氯聯苯誘導的大鼠肝微粒體酶（S-9）為體外代謝活化系統。試驗劑量為5 000，1 000，200，40和8 μg/皿，同時設自發回變，溶劑對照和陽性突變劑對照（2-氨基芴、9-芴酮、疊氮鈉、1、8-二羥基蒽醌、絲裂霉素C）。于37℃培養48 h，計數每皿菌落數。

1.2.2.3 小鼠精子畸形試驗

取25只試驗小鼠，隨機分為5組×5只。陽性對照：0.04 g/（kg·bw）環磷酰胺；陰性對照：1%羧甲基纖維素。試驗組劑量分別為10.00，5.00和2.50 g/（kg·bw）。連續5 d，每天灌胃1次，末次灌胃后的第30天處死動物，取副睪涂片，每只計數1 000個結構完整的精子，計算畸變的發生率。

1.3 試驗數據統計

用SPSS等軟件進行數據分析，結果以X±S表示。數據采用方差分析，先進行方差齊性檢驗，若方差不齊則對數據進行適當的變量轉化，若仍達到未方差齊，則采用秩和檢驗進行統計。

2 結果與分析

2.1 氨糖軟骨素鈣姜黃復合物對大鼠體重的影響

由表1可見，試驗前各組動物的初始體重差異沒有差異顯著性（P＞0.05）。假手術組大鼠的第8周末重、試驗末重及增重低于溶劑對照組，差異有顯著性（P＜0.05）。試驗劑量組與溶劑對照組體重，增重無顯著差異（P＞0.05）。通過體重及增重的階段性檢測，表明手術對大鼠產生影響，氨糖軟骨素鈣姜黃復合物對大鼠體重未造成不良影響。

表1 氨糖軟骨素鈣姜黃復合物對大鼠體重的影響

2.2 氨糖軟骨素鈣姜黃復合物對大鼠骨長度和骨密度的影響

由表2可見，各組試驗動物的股骨長度無顯著差異（P＞0.05）。假手術組，高劑量組大鼠股骨中心和遠心端骨密度高于溶劑對照組，差異有顯著性（P＜0.05）。高劑量氨糖軟骨素鈣姜黃復合物的干預，可促進大鼠骨密度的增加。氨糖、軟骨素、鈣及姜黃的組合使用，對骨密度有促進作用。

表2 氨糖軟骨素鈣姜黃復合物對大鼠骨長度和骨密度的影響

2.3 氨糖軟骨素鈣姜黃復合物對股骨質量和鈣含量的影響

由表3可見，各組試驗動物的股骨質量無顯著差異（P＞0.05）。假手術組，高劑量組骨鈣含量高于溶劑對照組，差異有顯著性（P＜0.05），高劑量氨糖軟骨素鈣姜黃復合物可提高大鼠骨鈣含量。復合物補充鈣，同時氨糖、軟骨素及姜黃也一定程度地促進鈣的吸收與轉化等。

表3 氨糖軟骨素鈣姜黃對大鼠股骨重量和鈣含量的影響

2.4 氨糖軟骨素鈣姜黃復合物的急性毒性試驗

氨糖軟骨素鈣姜黃復合物[20.00 g/（kg·bw）]給試驗動物灌胃后，動物未見明顯中毒癥狀，無顯著的體重變化，經過14 d的觀察無死亡。觀察期末處死受試動物進行解剖未見明顯異常，包括肝、脾、腎、腸、心、肺等主要器臟。氨糖軟骨素鈣姜黃復合物對雌雄小鼠的最大耐受劑量（MTD）大于20.00 g/（kg·bw），按保健食品分級標準[12]，屬無毒級。

表4 氨糖軟骨素鈣姜黃復合物的急性毒性試驗

2.5 Ames試驗

由表5和表6結果可見，對TA97a、TA98、TA100、TA102這4株試驗菌株，加與不加S-9，氨糖軟骨素鈣姜黃復合物的各劑量組回變菌落均未超過自發回變菌落數的2倍，無劑量-反應關系，為陰性[12]，氨糖、軟骨素、鈣及姜黃的組合使用較為安全。

表5 Ames試驗結果（第1次）（X±S）

表6 Ames試驗結果（第2次）（X±S）

2.6 小鼠精子畸形試驗

由表7可見，氨糖軟骨素鈣姜黃復合物干預的各試驗組的小鼠精子畸形發生率與陰性對照組比較無明顯差異（P＞0.05），而陽性對照組與陰性對照組比較差異有顯著性（P＜0.01）。試驗表明氨糖軟骨素鈣姜黃復合物對小鼠精子未造成畸形[12]，氨糖、軟骨素、鈣及姜黃的組合經毒理評價具有一定安全性。

表7 氨糖軟骨素鈣姜黃復合物對小鼠精子畸形發生率的影響

3 結論

以0.345，0.690和2.070 g/（kg·bw）劑量的氨糖軟骨素鈣姜黃復合物給雌性去勢SD大鼠灌胃90 d，2.070 g/（kg·bw）劑量組大鼠股骨中心和遠心端骨密度，骨鈣含量顯著高于溶劑對照組（P＜0.05），氨糖軟骨素鈣姜黃復合物對于大鼠有增加骨密度的作用[12]。林麗萍等[7]、郁樺等[13]研究表明氨糖與軟骨素協同作用促進骨密度，氨糖與軟骨素可通過促進軟骨增長，提高骨骼對鈣的攝取，進而提高骨密度。陽春華等[14]研究軟骨素加鈣的干預，表明軟骨素與鈣聯合使用可增加大鼠的骨密度。劉汝萃等[15]進行氨糖軟骨素鈣片的大鼠骨密度的試驗，結果表明氨糖軟骨素鈣片可顯著增加骨密度。王銅浩等[9]、李義等[11]研究姜黃對骨質疏松的影響，表明姜黃對骨密度等具有積極影響，姜黃通過抗炎、抗氧化等機制改善骨關節健康。小鼠試驗表明，氨糖軟骨素鈣姜黃復合物對雌雄小鼠的MTD大于20.00 g/（kg·bw），屬無毒級。Ames試驗表明，小鼠精子畸形均為陰性。氨糖軟骨素鈣姜黃復合物屬于實際無毒[12]。黃佳寧等[16]、林麗萍等[17]、魏慶鋼[18]、李慶等[19]研究也表明氨糖、軟骨素、姜黃食用安全，毒理學試驗為無毒級。鈣為常規膳食補充劑，也具有大量研究及食用歷史[20-22]。試驗中氨糖、軟骨素、鈣及姜黃食用安全，4種原料組合使用未造成試驗動物異常。氨糖、軟骨素、鈣及姜黃的組合對骨密度具有協同促進作用，并且具有一定安全性，可應用于保健食品等研究與開發。