基于網絡藥理學和分子對接探討復方黃精大蜜丸對抗衰老的機制

陳高策，吳鑫雨，陳永，宋子樂，吳超，梁澤華*

1. 浙江中醫藥大學藥學院（杭州 311499）；2. 浙江民泰醫藥有限公司（杭州 311200）

黃精是常用的藥食同源中藥，有多種活性物質。將黃精制成蜜丸最早記載于《太平圣惠方》[1]中。徐宇琳等[2]對黃精的藥食同源歷史進行考究，考究發現黃精有補精髓、壯筋骨、延年益壽等補養之效。在現代藥理研究中，黃精有增強免疫[3]、調節血糖血脂[4]、改善記憶[5]、防治骨質疏松[6]、抗癌[7-8]、抗衰老[9]、抗炎[10-11]等功效。而復方黃精大蜜丸是以黃精為主，輔以黃芪、人參、茯苓等藥物制成的具有一定保健功效的產品。

衰老是機體的組織器官受到各種因素的影響，導致結構和功能發生不可逆的退行性變化。同時衰老會導致各類疾病如阿爾茨海默病、癌癥等的發生率指數級增長。老年人口基數和比重的不斷提高，給公共醫療衛生和社會養老帶來極大挑戰。因此，延緩人類衰老速度具有極為重要的社會意義[12]。

網絡藥理學是新興學科，是一種基于疾病、藥物、有效成分、靶點基因、靶點蛋白相互作用的系統的分析方法[13]。近年來廣泛應用于中醫藥研究中，試驗借助網絡藥理學的方法，研究以被稱為“仙人余糧”的黃精作為主要成分的復方黃精大蜜丸，對抗衰老的潛在藥效成分、作用靶點及信號通路，為黃精的多樣化開發提供理論依據，開拓黃精作為保健食品的市場。

1 材料與方法

1.1 復方黃精大蜜丸的活性成分和靶點收集

運用TCMSP數據庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索復方黃精大蜜丸的十味中藥（黃精、黃芪、人參、茯苓、白芍、大棗、麻黃、生姜、松子仁、桂枝）的所有化學成分。接著根據口服生物利用度（OB）、類藥性（DL）對每個化學成分以OB≥30%，DL≥0.18為篩選條件進行篩選。運用TCMSP數據庫預測活性成分的作用靶點，借助Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/），限定基因來源為Homo sapiens且已驗證，將收集到的靶點名稱轉化為規范的基因ID。運用Cytoscape 3.9.1構建“藥物-活性成分-靶點”網絡圖。

1.2 衰老相關靶點收集

運用Gene Cards數據庫（https：//www.genecards.org/）以“aging”為檢索詞進行檢索以獲得衰老相關靶點，Gene Cards數據庫中Score值的高低和靶點與疾病聯系的密切度呈正相關，根據經驗最終篩選出Score值大于等于4.312 200 069的1 653個靶點納入試驗，將所得的靶點信息進行基因名和Uniprot ID的標準化，得到衰老的相關靶點。

1.3 “有效成分-疾病-靶點”網絡圖的繪制

將復方黃精大蜜丸活性成分靶點和疾病靶點取交集，得到交集靶點，利用Cytoscape 3.7.2軟件繪制“有效成分-疾病-靶點”網絡圖，根據degree值篩選出主要有效成分。

1.4 交集靶點PPI網絡構建

將藥物與疾病交集靶點上傳到STRING數據庫（https：//string-db.org）進行PPI網絡的構建，限定物種為“Homo sapiens”，隱藏游離節點，參數均為默認設置，得到PPI網絡文件，將其導入Cytoscape 3.9.1作圖并美化。

1.5 交集靶點GO和KEGG富集分析

將交集靶點數據導入David平臺（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）限定物種為“Homo sapiens”分析其生物學過程與通路，將數據運用微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）進行可視化處理。

1.6 分子對接

將“有效成分-疾病-靶點”網絡圖中degree較高的3個有效成分與PPI網絡中degree值最高的7個核心靶點進行分子對接。從TCMSP數據庫獲取有效成分的MOL2格式文件，從PDB數據庫（http：// www.rcsb.org/pdb）獲取核心蛋白質的PDB格式文件。使用AutoDockTools 1.5.7和PyMOL4.6.0對核心蛋白質進行去除水分子、金屬離子，分離配體和受體，加氫，轉化文件格式等操作。對接過程使用AutoDock Vina 1.1.2執行，將結果制成熱圖，并將結合能最低的模型運用PyMOL4.6.0進行可視化。

2 結果與分析

2.1 復方黃精大蜜丸的活性成分和靶點收集

從TCMSP數據庫中篩出藥物活性成分，其中白芍活性成分6個、大棗活性成分15個、茯苓活性成分3個、桂枝活性成分5個、黃精活性成分6個、黃芪活性成分11個、麻黃活性成分12個、人參活性成分10個、生姜活性成分3個、松子仁活性成分1個。篩選得到活性成分靶點分別有白芍79個、大棗188個、茯苓20個、桂枝42個、黃精75個、黃芪189個、麻黃203個、人參102個、生姜47個、松子仁19個。去除重復后，共得到活性成分26種，活性成分靶點259個。

2.2 衰老相關靶點收集

以“aging”為檢索詞在上述GeneCards數據庫中進行檢索，收集相關靶點，篩選得到相關靶點1 653個，將疾病靶點與活性成分靶點取交集，使用Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）制作韋恩圖最終得交集靶點160個，見圖1。

圖1 復方黃精大蜜丸活性成分靶點與衰老相關靶點韋恩圖

2.3 “有效成分-疾病-靶點”網絡圖的繪制

使用Cytoscape 3.9.1對160個交集靶點進行“有效成分-疾病-靶點”網絡圖的繪制，見圖2。根據度值篩選較為重要的活性成分，其中，槲皮素、山奈酚、異鼠李素的度值明顯較高，這些成分可能是復方黃精大蜜丸抗衰老的核心成分，見表1。

圖2 “有效成分-疾病-靶點”網絡圖

表1 復方黃精大蜜丸主要的活性成分信息

圖2中，方形圖標代表疾病與藥物的交集靶點，周圍的圓形圖標代表藥物的各個組分。圖形的大小由degree值決定，degree值越大圖形越大。

2.4 交集靶點PPI網絡構建

將上述160個交集靶點導入STRING數據庫，獲取PPI網絡圖，去除游離靶點后，導入Cytoscape 3.9.1進行直觀的拓撲分析，節點的大小和顏色的變化根據degree值而設定，degree值越大節點面積越大，顏色越深，反之節點面積越小，顏色越淺；邊線條的粗細和顏色的變化由Combined Score值決定，Combined Score越高連線越粗，顏色越深，反之連線越細，顏色越淺，見圖3。將degree值排名前7的蛋白篩選出來，見表2，復方黃精大蜜丸可能主要通過這些靶點起抗衰老的作用，認為這些靶點是復方黃精大蜜丸抗衰老的核心靶點。

圖3 復方黃精大蜜丸抗衰老靶點PPI網絡

表2 PPI網絡中degree值排名前7的靶點

2.5 交集靶點GO和KEGG富集分析

運用David數據庫對復方黃精大蜜丸抗衰老相關靶點進行信號通路分析。運用微生信進行可視化處理后，得到GO分析和KEGG分析圖，見圖4和圖5。可見“交集靶點”參與的生物學過程（BP）主要包括等RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控，基因表達的正向調控，信號轉導，對藥物的反應，DNA模板轉錄的正向調控，細胞增殖的正調節以及凋亡過程的負調控等。“交集靶點”細胞組分（CC）富集在質膜、胞質溶膠、細胞質、細胞核、核質、膜的組成部分、細胞外空間，細胞外區等。“交集靶點”主要分子功能（MF）富集在蛋白質結合、相同的蛋白質結合、酶結合、金屬離子結合、蛋白質同二聚化活性等。

圖4 復方黃精大蜜丸抗衰老交集靶點的GO富集分析圖

圖5 復方黃精大蜜丸抗衰老交集靶點的KEGG富集分析圖

KEGG富集分析進一步解釋復方黃精大蜜丸抗衰老的潛在機制，發現參與的通路主要有PI3K-Akt信號通路、化學致癌-受體激活、MAPK信號通路，這些通路可能是復方黃精大蜜丸抗衰老的關鍵通路。此外還有如癌癥通路、脂質和動脈粥樣硬化等通路，表明復方黃精大蜜丸可能參與相關疾病的調節。

2.6 分子對接

圖8 槲皮素與TNF分子對接結果

將復方黃精大蜜丸的核心成分槲皮素、山奈酚、異鼠李素和核心靶點AKT1（PDBID：3MV5）、TNF（PDBID：3L0V）、IL6（PDBID：2E43）、TP53（PDBID：5AB9）、IL1B（PDBID：4GAI）、CASP3（PDBID：1NMS）、VEGFA（PDBID：1VPP）進行分子對接，計算核心成分和核心靶點之間的結合能，預測其的結合活性，見圖6。一般認為結合能＜-5.0 kcal/mol表示具有較好的結合效果，所有的對接結果均小于0，且小于-5.0 kcal/mol，可見核心成分與核心靶點之間都能夠良好結合，證實復方黃精大蜜丸具有一定抗衰老功效。另外，核心成分槲皮素和核心靶點TNF結合能為-8.7 kcal/mol是所有對接結果中最小的結果，說明槲皮素也許能通過作用于TNF起到抗衰老的效果。對接結合能最小的3個模型運用PyMOL4.6.0展示兩者間的相互作用，見圖7～圖9。其中，虛化部分為核心靶點，未虛化部分為核心成分。

圖6 分子對接結合能熱圖

圖7 槲皮素與AKT1分子對接結果

圖9 山奈酚與TNF分子對接結果

3 討論

衰老是人類無法避免的最終結果，但是能夠通過抗衰老延長人類壽命及提高晚年的生活質量。同時抗衰老從社會層面上說，能夠緩解醫療衛生的壓力，減輕年輕勞動者的負擔。抗衰老藥物被分為化學藥物治療，生物治療及中藥治療。化學藥物治療的藥物有阿司匹林、雷帕霉素、二甲雙胍和白藜蘆醇等藥物。但是在服用的同時有明顯的高血糖、高脂血癥、腎臟毒性、免疫抑制、惡心、嘔吐不適等不良反應。生物治療包括干細胞移植、糞便微生物移植、激素替代療法、年輕血液置換等。但其實際應用尚需克服諸多難點，如干細胞移植可能會產生免疫排斥反應、出血和感染等風險；糞便微生物移植在實際情況中存在健康捐獻者糞便的篩選、移植方式及可能存在病原體傳播同時又缺乏標準化治療方案等問題。中藥治療主要通過清除自由基，提高抗氧化酶活性以及增強免疫功能的方式抗衰老[12]。中藥治療有著明顯優勢，如部分藥物藥食同源，毒性小或無毒性，無明顯不良反應，藥物的依順性較好可以長期服用。

中醫抗衰老理論主要集中于腎元氣虛致衰說、五臟虛損致衰說、陰陽失和致衰說、氣血失和致衰說以及氣虛、血虛、血瘀致衰說等。其中，腎元氣虛致衰說被廣為接受。腎為衰老之根，脾為衰老之源[14]。因此中醫理論上的抗衰老主要在于對腎和脾的補益作用。復方黃精大蜜丸，以黃精為主要成分，輔以黃芪、人參、茯苓等藥物。而黃精有補氣養陰，健脾，益腎的功效，被稱為“仙人余糧”，古書上記載“神仙餌黃精方，黃精十斤，洗凈，蒸令爛熟，白蜜三斤，件藥相和，搗一萬杵，圓如梧桐子大，每服以溫酒三十圓，日三服，久服神仙矣”。黃芪、人參、茯苓、白芍、大棗、生姜等均有不同程度的補脾健脾的功效。互相配伍能夠起到“1+1＞2”的作用。復方黃精大蜜丸味甘甜，口感綿密，便于服用且依順性較為良好。本研究使用網絡藥理學及分子對接的方法，探討復方黃精大蜜丸抗衰老的可能機制，為復方黃精大蜜丸的進一步開發提供基礎。

根據“有效成分-疾病-靶點”網絡圖篩選出的3個有效成分槲皮素、山奈酚、異鼠李素均為黃酮類。有研究證明槲皮素可以增強線粒體生物發生與氧化磷酸化作用，并降低與線粒體相關的細胞凋亡達到延長老年低額溞壽命的作用[15]。異鼠李素可以通過減輕氧化應激，延緩D-半乳糖誘導的人臍靜脈內皮細胞衰老[16]。但是山奈酚抗衰老的內容較少，值得后續進行研究。

通過藥物與疾病的交集靶點制得的PPI網絡圖篩選得到degree值最高的7個復方黃精大蜜丸抗衰老的核心靶點，分別為AKT1、TNF、IL6、TP53、IL1B、CASP3、VEGFA，其中AKT1的degree值最高，其可能是復方黃精大蜜丸抗衰老的關鍵靶點AKT1[17]，通過調節細胞的自噬從而抑制細胞的衰老。Figueira等[18]發現，年齡相關的炎癥因子如IL-6、TNF-α表達異常與衰老有關。腫瘤蛋白p53（TP53）是一種腫瘤抑制蛋白，其調控腫瘤發生與衰老進程。相關試驗表明，過表達TP53可誘導細胞衰老，在小鼠體內異常激活p53可降低腫瘤發生率，但也導致小鼠衰老。進一步研究發現，高表達且受到正常調控的p53在提高機體對腫瘤耐受性的同時，不會導致過早衰老和壽命縮短[19]。

GO分析與KEGG富集分析是分析基因功能的有效方法，GO分析表明復方黃精大蜜丸抗衰老涉及多個生物學過程，如RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控，基因表達的正向調控，信號轉導，對藥物的反應，DNA模板轉錄的正向調控，細胞增殖的正調節及凋亡過程的負調控等。KEGG結果表明交集靶點主要富集在PI3K-Akt信號通路、化學致癌-受體激活、MAPK信號通路等上。這些通路可能是復方黃精大蜜丸抗衰老的主要通路。PI3K-Akt信號通路是細胞內重要的通路之一，參與調控細胞分化、增殖和凋亡等多種生理活動，常與轉錄因子NF-E2相關因子2共同作用，以調節氧化應激造成的細胞損傷，該通路被激活可延緩機體衰老[20]。賴文芳等[21]發現紅景天苷能夠改善MCAO大鼠的神經功能損傷，抑制神經細胞凋亡，主要是通過激活PI3K-AKT信號通路，促進AKT的磷酸化，激活NRF2的核轉錄，促進HO-1的蛋白表達，進而抑制神經細胞凋亡，改善神經功能。Ali等[22]發現花青素通過激活PI3K-Akt-Nrf2信號通路降低ROS水平，減輕氧化應激引起的細胞損傷及阿爾茨海默病小鼠的神經退行性改變，從而延緩衰老。絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是重要的信號轉導酶，參與調節細胞凋亡、細胞增殖分化和衰老等[23]。楊曉露等[24]發現，甘草總黃酮能抑制細胞中炎癥因子的表達，下調激活MAPK信號通路中磷酸化的ERK（p-ERK）蛋白表達，通過調控ERK-MAPK通路發揮抗炎、抗氧化作用，延緩衰老。宋來新等[25]發現，淫羊藿總黃酮對自然衰老大鼠炎癥反應具有保護作用，其作用機制可能是通過抑制MAPK信號通路的激活，從而抑制NF-κB的核易位及其下游炎癥細胞因子表達，進而延緩腦衰老。最后，3個核心成分與7個核心靶點的分子對接結果展示核心靶點與核心成分之間良好的結合活性，這也印證復方黃精大蜜丸抗衰老的科學性。

4 結語

試驗運用網絡藥理學的方法，篩選出復方黃精大蜜丸抗衰老的3個主要活性成分，這些活性成分可能通過AKT1、TNF、IL6、TP53等關鍵靶點，參與PI3KAkt信號、MAPK信號等通路，發揮RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控，基因表達的正向調控，信號轉導，對藥物的反應，DNA模板轉錄的正向調控，細胞增殖的正調節及凋亡過程的負調控等作用從而達到抗衰老目的，同時分子對接也驗證了核心靶點與核心成分的高度結合活性。試驗初步闡明復方黃精大蜜丸抗衰老的主要藥效成分及其可能的作用靶點和相關通路，為后續以黃精為主要成分的保健食品進一步開發提供思路和方向。