HPLC-MS/MS測定油菜花蜂蜜中20種磺酰脲類除草劑

田亞，張淑霞，孫轉蓮，王向軍

鄭州海關技術中心（鄭州 450016）

油菜是我國優質的蜜源植物，油菜田間的雜草以化學防除為主[1-2]。磺酰脲類除草劑被目前各國廣泛應用，且使用量較高，對于油菜田中的闊葉及禾本科雜草具有較好的防治效果[3]。大多數磺酰脲類除草劑屬于長殘效除草劑，其在農作物中的殘留會對農作物造成多種危害，且殘留物通過環境進入食物鏈，對人類具有潛在風險和毒性[4-5]。油菜花蜂蜜除含有豐富的維生素、果糖以外，還有大量黃酮，長期食用能夠促進胃腸道消化、排毒養顏、提高免疫力、保護心血管、預防動脈粥樣硬化，是日常普遍食用和保健的天然產品。蜜蜂在油菜花田采蜜，會將大量除草劑殘留物傳遞到油菜花蜂蜜中，對人類健康產生威脅。因此，建立一種檢測油菜花蜂蜜中磺酰脲類除草劑殘留方法對于食品安全問題具有重要價值及影響意義。

近年來，對于磺酰脲類除草劑殘留量的檢測方法主要有氣相色譜法[6]、高效液相色譜法[7-9]和液相色譜-串聯質譜法[10-14]。采用氣相色譜法分析時，由于磺酰脲類除草劑具有強極性、高沸點的特性，需要進行衍生化處理，其操作繁雜，不適合日常多殘留的快速檢測。采用高效液相色譜法分析時，由于液相色譜的選擇性差，蜂蜜除了主要成分果糖、葡萄糖和水分外，還含有一些蛋白質、氨基酸、有機酸、多酚類物質和維生素等，基質較為復雜，當目標物檢測數量多時，分離難度大，容易導致干擾物與目標待測物同時出峰，造成干擾，且許多國家對磺酰脲類除草劑的最大殘留限量規定較低，高效液相色譜法靈敏度達不到限量要求。液相色譜-串聯質譜法選擇性高、靈敏度強、穩定性好、抗干擾能力突出，因此可作為分析磺酰脲類除草劑殘留量的優選方法[15]。關于同時測定油菜花蜂蜜中多種磺酰脲類除草劑的方法尚未有報道。試驗采用QuEChERS方法進行凈化處理，高效液相色譜-串聯質譜法測定油菜花蜂蜜中20種磺酰脲類除草劑的殘留量，該方法操作簡便快捷、靈敏度高、準確性好，可為蜂蜜中農藥殘留的快速測定和風險評估提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

酰嘧磺隆、芐嘧磺隆、氯嘧磺隆、氯磺隆、醚磺隆、環丙嘧磺隆、乙氧磺隆、氟吡磺隆、氯吡嘧磺隆、甲基碘磺隆、甲基二磺隆、嗪吡嘧磺隆、甲磺隆、嘧苯胺磺隆、丙嗪嘧磺隆、吡嘧磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、氟胺磺隆和三氟甲磺隆標準品（質量分數均＞97%，德國Dr. Ehrenstorfer公司）。

乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、石墨化炭黑（GCB）：美國Agilent公司。

乙腈、甲醇（色譜純，德國默克）；甲酸（色譜純，美國ACS）；無水MgSO4、氯化鈉（分析純，天津科密歐）；甲酸銨（色譜純，天津科密歐）；有機濾膜（0.22 μm，美國PALL）；水為GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規格和試驗方法》規定的一級水；油菜花蜂蜜（購于鄭州市各大超市，于20 ℃保存）。

1.1.2 儀器與設備

高效液相色譜-串聯四極桿質譜儀[LC-MS/MS，安捷倫6470（配Agilent 1290 Infinity Ⅱ液相色譜），美國Agilent公司]；電子天平（感量0.01 mg，MettLer ToLedo，XPE105-S/FACT）；臺式高速冷凍離心機（5427 R，德國Eppendorf公司）；氮吹儀（N-EVAP 112，美國Organomation公司）；Heidolph multi reax多功能振蕩器（德國heidolph公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配制

1.2.1.1 標準儲備液（1 000 μg/mL）

分別準確稱取適量的20種磺酰脲類除草劑標準品，用乙腈溶解并定容，分別得到質量濃度為1 000 μg/mL的標準儲備液（折算每種標準品的純度），在-18 ℃條件下儲存。

1.2.1.2 混合標準中間液（10 μg/mL）

分別準確移取適量各標準儲備液于容量瓶中，用乙腈稀釋定容至刻度，得到10 μg/mL的混合標準中間液，在-18 ℃條件下儲存。

1.2.1.3 基質混合標準曲線

將混合標準中間液（10 μg/mL）根據需求稀釋，得到1 μg/mL的混合標準工作液，以陰性蜂蜜樣品提取液配制質量濃度為0.2，0.5，1.0，5.0，10，50，100和200 μg/L的標準溶液，進行測定并繪制標準曲線。

1.2.2 樣品前處理

對于未結晶的油菜花蜂蜜樣品，將其混勻。對于有結晶的油菜花蜂蜜樣品，在密閉條件下低于50 ℃水浴中溫熱，振蕩，待樣品全部融化后混勻，放置室溫冷卻。

精密稱取2.00 g混勻后的蜂蜜于50 mL離心管中，加入5 mL水稀釋，渦旋混勻2 min，加入10 mL 1%甲酸乙腈和5.0 g氯化鈉，旋渦混勻2 min，以4 000 r/min離心5 min，準確量取5.0 mL上層提取液至含有50 mg PSA和25 mg C18吸附劑的50 mL離心管中，旋渦混勻2 min，以4 000 r/min離心5 min，過有機濾膜后供LCMS/MS測定。

1.2.3 LC-MS/MS分析

1.2.3.1 色譜條件

色譜柱Agilent Eclipse Plus C18RRHD（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫40 ℃；流動相B相0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸銨甲醇溶液；A相0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸銨水溶液；流量0.3 mL/min；進樣量5 μL；流動相梯度洗脫條件見表1。

1.2.3.2 質譜條件

離子源，電噴霧ESI；正離子；掃描方式采用多反應監測MRM；干燥氣流速350 ℃；干燥氣溫度10 L/min；霧化氣壓力276 kPa；鞘氣流速11 L/min；鞘氣溫度375 ℃；毛細管電壓3 500 V。

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化

分別進行電噴霧ESI+、ESI-模式掃描，結果發現[M+H]+的加合離子信號高且穩定，故20種磺酰脲除草劑均為ESI+模式掃描。優化每個母離子對應的最優裂解電壓，進而得到強弱不同的子離子碎片，施加不同的碰撞能量以得到最佳豐度的離子，豐度值最高的離子對為定量離子，次級豐度值的離子對為定性離子。同時在MRM模式下對鞘氣溫度及流速、干燥器溫度及流速、毛細管電壓等參數做進一步優化，從而獲得最優質譜條件。20種化合物的質譜參數見表1。

表1 20種目標物的質譜參數及色譜保留時間

接表1

2.2 色譜條件優化

由圖1和圖2可知，方法中20種磺酰脲類除草劑的峰形及分離效果較好，通過對色譜條件進行優化，選擇液相色譜常用的甲醇和乙腈兩種有機溶劑，由于磺酰脲類除草劑為弱酸性化合物，在甲醇、乙腈中分別加入0.01%甲酸和2 mmol/L甲酸銨，可明顯提高電噴霧離子化效率，通過對比發現0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸銨甲醇溶液比0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸銨乙腈溶液對20種磺酰脲類除草劑分離效果更充分，響應值更高。同時考察0.01%甲酸-5 mmol/L甲酸銨水溶液、0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸銨水溶液及0.01%氨水作為流動相的分離情況，通過對比0.01%氨水分離效果較差，0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸銨水溶液質譜響應值最高，且目標物峰形及保留時間重現性均較好。故試驗選用0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸銨水溶液與0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸銨甲醇溶液作為流動相。另外，為使20種磺酰脲類除草劑的分離效果達到最佳，進而優化流動相洗脫條件，結果見表2。

表2 流動相梯度洗脫條件

圖1 20種目標物總離子流色譜圖

圖2 20種目標物定量離子色譜圖（10 μg/L）

2.3 前處理方法的優化

2.3.1 提取溶劑的選擇

在油菜花蜂蜜樣品中加入水溶解稀釋，通過有機試劑進行提取，可起到去除一定糖分的作用。磺酰脲類除草劑具有弱酸性，在酸性條件下從水相中提取到有機相較為容易，故通過加標回收對比甲醇、乙腈、1%甲酸甲醇、1%甲酸乙腈對目標待測物的提取效果。由圖3可知，以甲醇、1%甲酸甲醇為提取液時，由于甲醇不能與水分層，20種目標待測物除醚磺隆外，其余化合物的回收率均低于60%，提取效果較差，其中甲磺隆、苯磺隆、氯磺隆回收率分別為11.3%，12.48%和17.48%，提取效果最差。以乙腈為提取液時，目標化合物的回收率為52.77%～91.94%，提取效果顯著提高。以1%甲酸乙腈為提取液時，回收率為64.91%～101.81%，由于磺酰脲類除草劑在結構和體系的pH影響下容易水解，乙腈中加入1%甲酸能夠有效提高易水解目標物的穩定性，進而提高待測目標物的提取效果。

圖3 20種磺酰脲類除草劑在4種溶劑提取下的回收率（加標10 μg/kg）

2.3.2 凈化方法的選擇

QuEChERS凈化方法是運用不同的吸附劑與樣品中雜質相互作用，從而實現凈化目標化合物的效果，具有快速、簡便、高效、使用范圍廣等優點，適用于極性、非極性、高酸堿性等化合物，常用的吸附凈化劑有乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、石墨化炭黑（GCB）和無水硫酸鎂[16]。由圖4可知，分別采用PSA（50 mg）、C18（50 mg）、GCB（50 mg）和無水硫酸鎂（50 mg）對5 mL提取液進行凈化時，GCB和無水硫酸鎂凈化效果較差，部分目標化合物回收率低于60%，凈化效果差異較大，且GCB對乙氧磺隆和芐嘧磺隆有明顯吸附效應。PSA和C18對目標待測物的凈化效果顯著，PSA可以去除蜂蜜樣品中的葡萄糖、果糖、有機酸、多酚類等極性物質，C18可以吸附蜂蜜樣品中的蛋白質、芳香物質中的酯類等非極性物質。為進一步優化凈化劑使用量，進而采用PSA和C18不同的配比組合進行試驗，由圖5結果可知，并不是PSA和C18添加量越多越好，隨著PSA和C18添加量增加，目標待測物的回收率普遍呈下降趨勢，PSA添加量50 mg，C18添加量25 mg時目標待測物回收率為77.5%～104.18%，其凈化效果最好。

圖4 20種磺酰脲類除草劑在4種凈化劑下的回收率（加標10 μg/kg）

圖5 20種磺酰脲類除草劑在PSA和C18不同使用量下的回收率（加標10 μg/kg）

2.4 工作曲線、檢出限和定量限

以陰性樣品的提取液配制目標待測物質量濃度為0.2，0.5，1.0，5.0，10，50，100和200 μg/L的標準工作液，以待測物濃度為橫坐標，其對應峰面積為縱坐標繪制校準曲線。由表3可知，20種目標化合物分別在各自的線性范圍內呈良好關系，相關系數（r）均＞0.999 1。方法靈敏度采用低水平陰性樣品加標來測試，檢出限以信噪比（rSN＞3）所對應的加標濃度計，為0.5～1.0 μg/kg；定量限以信噪比（rSN＞10）所對應的加標濃度計，為1.0～2.5 μg/kg。

表3 線性方程、檢出限和定量限

2.5 方法回收率與精密度

準確稱取陰性油菜花蜂蜜樣品，分別添加10，50和100 μg/kg質量分數水平的20種磺酰脲類除草劑的標準混合液，采用上述方法進行樣品加標回收處理，每個濃度水平分別進行6個平行試驗，計算加標回收率及測定值的SRSD，結果見表4。計算所得加標平均回收率為77.9%～104.1%，SRSD均小于10%，該方法的回收率與精密度較好。

表4 20種磺酰脲類除草劑的加標平均回收率及SRSD（n=6）

2.6 實際樣品檢測

從超市選購6個油菜花蜂蜜，采用試驗方法對樣品進行測定，結果顯示，20種磺酰脲類除草劑均未檢出，且樣品譜圖無干擾峰，表明油菜花蜂蜜中檢出磺酰脲除草劑的風險較低，具有較高的安全性。

3 結論

通過對質譜條件、液相色譜條件及前處理方法進行優化，建立一種QuEChERS-LC-MS/MS測定油菜花蜂蜜中20種磺酰脲類除草劑殘留量的分析方法，并驗證線性范圍、檢出限（LOD）、定量限（LOQ）、回收率、精密度等方法學指標。方法操作簡單快捷，具有較高的靈敏度、準確度和精密度，且尚未有對蜂蜜中磺酰脲類除草劑殘留量的風險評估報道，為建立蜂蜜中磺酰脲類除草劑殘留量的檢測方法提供數據支撐，并為其批量篩查和風險監測提供參考。