固相萃取-氣相色譜質譜法測定食糖中丙烯酰胺

李海霞，陳克云，李霞，梁秀清，陳倩倩，劉艷明

山東省食品藥品檢驗研究院，國家市場監管重點實驗室（肉及肉制品監管技術），山東省特殊醫學用途配方食品質量控制工程技術研究中心，山東省食品藥品安全檢測工程技術研究中心（濟南 250101）

糖作為生活必需品和期貨戰略商品，在國家經濟發展中扮演不可或缺角色[1]。但2015年臺灣康健雜志抽檢的19包市售黑糖全部檢出致癌物質丙烯酰胺[2]，引起社會的普遍關注。丙烯酰胺可導致細胞遺傳物質DNA的損傷，高劑量的暴露會影響人和動物的神經和生殖系統[3-4]。食糖中丙烯酰胺主要來自兩方面：一是甘蔗汁反復高溫熬煮下天門冬酰胺和單醣（葡萄糖、果糖）產生美拉德反應生成丙烯酰胺，二是食糖生產過程使用聚丙烯酰胺作絮凝劑的殘留和降解[5-8]。

食糖中丙烯酰胺分析方法較少，主要集中在高效液相色譜法[9-10]、高效液相色譜-串聯質譜法[11-12]和氣相色譜-串聯質譜法[12]。高效液相色譜法檢測器選擇性差；高效液相色譜-串聯質譜儀價格昂貴，檢測費用高；氣相色譜質譜聯用技術多采用溴代衍生，存在操作繁瑣、檢驗周期長，衍生試劑毒性大等問題[13-14]。調查大批量食品樣品時，快速并準確地分析食品中丙烯酰胺變得越來越重要。試驗以食糖為對象，將Cleanert ACA固相萃取小柱應用到食糖基質，不經衍生直接進氣相色譜質譜儀檢測，內標法定量，為企業質量控制和政府風險監測提供有力技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

氣相色譜-質譜聯用儀（8890/5977B，安捷倫科技公司）；電子分析天平（SQP，北京賽多利斯）；超純水機（IQ7000，Mili-Q）；渦旋混合器（MS3，IKA公司）；超聲清洗機（KQ-800DE，昆山市超聲儀器有限公司）。

丙烯酰胺標準品（中國計量院）；13C3-丙烯酰胺標準品（曼哈格）；甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；丙酮（色譜純，美國Fisher公司）；Cleanert ACA（6 mL、200 mg）固相萃取小柱（Agela公司）；Oasis HLB（6 mL、500 mg）固相萃取小柱（Waters公司）；食用糖（黑糖和白糖，市售）。

1.2 標準溶液的配制

13C3-丙烯酰胺內標溶液（10 mg/L）：準確移取100 μL13C3-丙烯酰胺標準品（1 000 mg/L）于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，置于-20 ℃冰箱保存。

丙烯酰胺標準儲備溶液（1 000 mg/L）：準確稱取丙烯酰胺標準品，用乙腈溶解并定容，使丙烯酰胺質量濃度1 000 mg/L，置-20 ℃冰箱中保存。用乙腈稀釋配成10 mg/L的標準工作溶液，在0～4 ℃冰箱中避光保存，臨用時配制。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品制備

稱取1 g（精確至0.001 g）食糖試樣于15 mL離心管中，加入50 μL 10 mg/L13C3-丙烯酰胺內標溶液，用2 mL超純水溶解，渦旋混勻，超聲2 min使其充分溶解，待凈化。

1.3.2 凈化

固相萃取小柱（Cleanert ACA）預先用5 mL甲醇和5 mL超純水活化，將2 mL樣品提取液（靠重力流）通過已活化好的固相萃取小柱，上樣結束后用5 mL超純水淋洗，真空泵抽干1 min，用2 mL乙腈洗脫，供氣相色譜-質譜儀分析。

1.4 儀器檢測條件

1.4.1 氣相色譜條件

色譜柱DB-WAX MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度200 ℃；進樣模式為不分流；載氣為氦氣，流速1 mL/min；程序溫度：65 ℃保持1 min，15 ℃/min升溫至240 ℃保持10 min。

1.4.2 質譜條件

離子化模式為電子轟擊離子源，EI 70 eV；采集模式SIM。離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；傳輸線溫度260 ℃；溶劑延遲5 min。丙烯酰胺特征離子碎片71，55，44和43，13C3-丙烯酰胺特征離子碎片71，56，43和72。

1.5 基質效應評價方式

采用基質匹配標準曲線的斜率與溶劑標準曲線的斜率的比值，定量評價丙烯酰胺的基質效應。

式中：ME為0表示無基質效應，絕對值越大表明基質效應越強，在-15%～15%之間，表示基質效應影響不明顯。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優化

2.1.1 提取溶劑的選擇

樣品的提取是復雜基質檢測的重要步驟，提取溶劑的選擇對提取效率有著重要的影響。丙烯酰胺為極性化合物，極易溶于水（在30 ℃時為2 155 g/L），食糖在水中溶解度極大，20 ℃的水中溶解度是110 g，以水作為提取劑可最大限度將食糖中丙烯酰胺提取完全，且水作為提取劑成本低、無污染，因此最終選取水作為提取溶劑。

2.1.2 凈化方式的選擇

食糖樣品經水提取后，蔗糖、色素等水溶性成分或雜質也溶解于提取溶劑中，對痕量丙烯酰胺的檢測產生干擾，因此樣品檢測前的凈化處理十分必要。近年來，固相萃取技術因其簡便、快速、環保等優勢在丙烯酰胺檢測中應用廣泛，被迅速地推廣。該方法簡單、穩定、準確、可重復性好，集富集、凈化、濃縮于一體，在氣相色譜檢測技術中應用廣泛。

丙烯酰胺常用的凈化柱有Oasis HLB和Cleanert AcA。Oasis HLB小柱的吸附劑是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，其保留機理為反相，通過一個特殊的極性捕獲基團增加對極性物質的保留[15]。Cleanert ACA固相萃取柱的填料為一種特殊的碳材料，極性位點豐富，對丙烯酰胺具有極強的吸附作用[14]。試驗選擇Oasis HLB和Cleanert AcA這2種固相萃取柱對丙烯酰胺的凈化效果進行比較。在進行500 ng丙烯酰胺標準溶液上樣外標法定量過程中發現，Oasis HLB固相萃取小柱回收率只有5.4%，大量研究[16-17]中HLB是對丙烯酰胺的富集效率很高且凈化效果很好的一種固相萃取小柱，但在試驗中HLB對丙烯酰胺的回收率僅5.4%，主要有幾個方面的原因：HLB小柱使用反相保留機制，可直接用純水洗脫，試驗為除去蔗糖對目標物的基質影響，用水淋洗HLB小柱，使得大部分吸附在HLB小柱上的目標物在淋洗過程中隨蔗糖一起淋洗掉；試驗為尋找更簡便快速檢測目標物方法，并未選擇水作為洗脫劑以便省去轉換進樣溶劑步驟，因目標物可與HLB骨架上的N-乙烯吡咯烷酮結構發生氫鍵作用，非質子溶劑（如乙腈）不適合對目標物進行有效洗脫。因此，Oasis HLB小柱不符合試驗凈化目的，不適合用于食糖中丙烯酰胺的凈化。相反，Cleanert AcA小柱因其填料為比表面積大的椰殼活性炭，對目標物有更大的吸附容量，對丙烯酰胺的加標試驗回收率為85.5%，證明其對丙烯酰胺保留效果較好，所以，選用Cleanert ACA固相萃取小柱對樣品進行凈化處理，見圖1。

圖1 不同洗脫劑對丙烯酰胺回收率的影響

2.1.3 淋洗溶劑體積的考察

為減少固相萃取柱上吸附的蔗糖、色素等水溶性雜質對丙烯酰胺測定的影響，試驗用水進行淋洗，考察淋洗體積對丙烯酰胺回收率和基質效應的影響。回收率試驗結果顯示，淋洗劑用量為0～15 mL（0，1，2，5，10和15 mL）時，丙烯酰胺回收率在80%～89%范圍內，沒有明顯的變化趨勢，推測主要是因為Cleanert ACA柱子的填料為比表面積較大的椰殼活性炭，極性位點豐富，對目標化合物有極好的保留。基質效應評價試驗結果顯示淋洗劑用量在0～15 mL時白糖和紅糖不同基質效應對丙烯酰胺的影響也很小，白糖ME在1.4%～7%之間，紅糖ME在6.2%～13.3%之間，基質效應變化不明顯。

但在試驗過程中通過凈化液純凈度發現，淋洗體積0～2 mL時，液體較渾濁，離心后，底部出現不溶物（紅糖更明顯），推測由于Cleanert ACA凈化柱對丙烯酰胺有極大吸附性，淋洗劑洗掉的大部分為食糖中雜質，但淋洗劑用量較少時，殘留的部分色素、蔗糖雜質隨洗脫劑洗脫進入凈化液。在保證雜質被淋洗的同時且用時、用水較少，最終選擇5 mL作為淋洗劑的用量體積。

2.1.4 洗脫溶劑的考察

丙烯酰胺極性較強，既溶于水又溶于有機溶劑，根據相似相溶原理，選擇中等或極性較強的洗脫溶劑才能將目標物洗脫下來，試驗選用甲醇、乙腈和丙酮等有機溶劑作為洗脫劑的考察，回收率試驗結果顯示，洗脫溶劑為乙腈時的洗脫效果最好，因此選用乙腈作為試驗的洗脫劑，見圖1。

2.1.5 洗脫溶劑體積的優化

為確保SPE柱上富集的丙烯酰胺能夠被完全洗脫下來，考察不同洗脫體積對丙烯酰胺洗脫效果。回收率結果顯示（見圖2），洗脫溶劑體積在0.5～2 mL范圍內，回收率顯著增加，洗脫體積大于2 mL時，回收率變化不明顯。綜合考慮回收率和時間成本，選擇2 mL作為最佳洗脫體積。

圖2 不同體積洗脫劑對丙烯酰胺回收率的影響

2.2 定量方式的考察

樣品基質效應的存在影響質譜方法定量的準確性，因此有必要對建立的質譜方法進行基質效應考察。按1.3樣品前處理過程處理后，在空白食糖樣品中加入一定量丙烯酰胺標準溶液，配成質量濃度為10，20，50、100，200，500和1 000 ng/mL的基質標準溶液曲線，與用乙腈溶液直接配制的相同濃度純溶劑標準曲線直接上機對比分析，計算兩者斜率的比值，定量評價丙烯酰胺的基質效應。計算結果表明，白糖的ME為-2.99%，紅糖的ME為-6.21%，基質效應影響不明顯。因此試驗無需使用基質匹配的標準曲線進行定量，可直接使用溶劑標準曲線定量分析。

為更準確定量食糖中丙烯酰胺含量，考察同位素內標與外標法定量的差別。試驗發現，外標法定量樣品回收率在75%～85%范圍內，同位素內標定量時回收率在90%～113%范圍內。由于13C3-丙烯酰胺內標與待測化合物有相同的化學結構和性質，且有較高的穩定性，定量加入13C3-丙烯酰胺內標可極大程度地降低待測物在提取、凈化、進樣時由于人工操作產生的隨機誤差或儀器及方法產生的偶然誤差而造成的數據偏離，使丙烯酰胺在提取效率、凈化損失和基質效應等方面得到校正，提高檢測結果的準確度和精密度。因此，該方法采用同位素內標法進行定量。

2.3 方法學考察

2.3.1 標準曲線

移取系列質量濃度為10，20，50，100，200，500和1 000 ng/mL的丙烯酰胺標準溶液，用乙腈定容到1 mL，進行氣相色譜-質譜分析。以各標準溶液中丙烯酰胺與內標溶液的濃度比為橫坐標，以丙烯酰胺與內標溶液的相對響應為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明，在10～1 000 ng/mL范圍內丙烯酰胺線性關系良好，符合定量要求，標準曲線的線性方程為y=0.853 850x+0.085 473，相關系數r為0.999 1。

2.3.2 方法檢出限與定量限

在食糖空白樣品中添加10 μg/kg的丙烯酰胺標準溶液，采用氣相色譜-質譜測定，以3倍信噪比計算方法檢出限，以10倍信噪比計算其定量限，得出檢出限（SLOD）為10 μg/kg，定量限（SLOQ）為20 μg/kg。標準溶液的典型色譜圖見圖3。

圖3 標準溶液（質量濃度100 ng/mL）的總離子流圖

2.3.3 精密度和準確性

在優化試驗條件下，對丙烯酰胺陰性白糖和紅糖樣品進行加標回收試驗。稱取食糖樣品，分別添加3個水平的丙烯酰胺標準溶液，按照所建立的方法分析條件進行測定。每份樣品進行6次平行測定，考察方法的回收率、精密度和準確性。空白樣品和最低加標濃度譜圖見圖4。

圖4 空白樣品和加標樣品譜圖

結果表明，陰性白糖樣品中丙烯酰胺的加標回收率在90.42%～106.32%范圍內，陰性紅糖樣品中丙烯酰胺的加標回收率在97.00%～113.93%范圍內，滿足GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》要求。相對標準偏差（SRSD）＜10%，試驗數據表明該方法重復性好，適合食糖中丙烯酰胺的測定，見表1。

表1 食糖中丙烯酰胺的回收率和精密度（n=6）

2.4 實際樣品分析

對超市采購的不同品牌的5份白糖樣品和9份紅糖樣品分別采用試驗方法、GB 5009.204—2014《食品中丙烯酰胺的測定》和SN/T 2096—2008《食品中丙烯酰胺的檢測方法-同位素內標法》進行數據比對，結果表明，白糖樣品均未檢出丙烯酰胺，紅糖樣品8份檢出，丙烯酰胺含量300.2～1 403.9 μg/kg。3種方法進行比較可知，相對偏差符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》附錄F要求的含量為0.010～10 mg/kg樣品的檢測結果偏差范圍為-20%～10%的要求，見表2。

表2 不同食糖樣品中丙烯酰胺的測定結果

接表2

按照世界衛生組織《食品污染物工作報告》中丙烯酰胺攝入限量180 μg/kg，1名體重50 kg的女性，每天丙烯酰胺的安全攝入量是9 mg，如果每天喝200 g紅糖水，按10%的含糖量（20 g）計算，攝入的丙烯酰胺數量只有28.1 μg，并不會對健康造成危害。

3 結論

試驗針對食糖基質，采用水提取，SPE凈化柱凈化，內標法定量，建立快速測定食糖中丙烯酰胺含量的分析方法，經過驗證，該方法的線性范圍、檢出限、回收率、精密度和準確性等方法學指標均滿足食糖中丙烯酰胺的定性定量分析，且方法簡便快速、有機溶劑用量少、基質效應低，回收率高，可為食糖中丙烯酰胺的監測和風險評估提供方法學基礎。