MBD2對Th2/Th17細胞平衡的調控及其在哮喘中的作用研究①

馬乙云 鄭亞妹 許玉妮 （海南省人民醫院， 海南醫學院附屬海南醫院檢驗科，海口570311）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是常見的一種呼吸系統慢性疾病，其特征是氣道反應性增高，臨床表現主要為反復發作的喘息、氣促、胸悶和（或）咳嗽等癥狀，嚴重者可危及生命［1］。流行病學數據顯示，我國約有超3 000萬哮喘患者，病死率高達49.2/10萬，居世界第一，給社會及家庭造成嚴重經濟負擔［2］。眾所周知，Th細胞比例失衡在哮喘的發病機制中占重要地位［3］。大量數據分析發現嗜酸性粒細胞炎癥類型是臨床上最常見的哮喘類型，其次是以嗜酸性粒細胞和中性粒細胞混合浸潤的氣道炎癥類型（又被稱為以中性粒細胞主導的哮喘），而后者對經典的糖皮質激素吸入性治療方法并不敏感［3-4］。而中性粒細胞介導的哮喘并不依賴經典的Th2細胞途徑，研究表明其主要以Th17及其相關細胞因子為主［3，5］。

甲基CpG結合區域蛋白2（methyl-CpG binding domain protein 2，MBD2）能夠特異性結合靶基因的啟動子區域，并通過招募其他分子改變組蛋白的轉錄后修飾，改變染色質結構，從而調控靶基因的表達［6］。本課題組既往研究發現MBD2能夠調控多種基因的表達，如細胞因子傳導抑制蛋白3（SOCS3），干擾素調節因子4（IRF4）、缺氧誘導因子1（HIF-α）的表達而參與Th17細胞的分化［7-9］。然而，均未在體內實驗進行系統地探究MBD2對哮喘發病及Th2與Th17細胞分化的影響。鑒于此，本實驗通過屋塵螨聯合卵清蛋白與脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）對條件基因敲除小鼠進行誘導重癥哮喘模型，觀察MBD2在其發病過程中的作用及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料 由南方模式動物研究中心應用Cre-flox體系與Crisper-cas9 方法構建C57BL/6小鼠的CD4CreMBD2fl/fl及MBD2fl/fl對照品系（WT）；屋塵螨（house dust mite，HDM）（美國Greer公司）；LPS、氫氧化鋁凝膠、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、乙酰膽堿（methacholine，Mch）（美國Sigma公司）；TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；4%甲醛、戊巴比妥鈉（武漢博士德生物公司）；FITC、APC、PE標記的大鼠抗小鼠CD4（FITC-CD4）、IL-17（APC-IL-17）及IL-4（PEIL-4）（美國Biolegend公司）；CD4+T細胞磁珠分選試劑盒（德國Miltenyi生物公司）；攜帶靶向沉默MBD2基因的siRNA（si-MBD2）與陰性對照序列si-NC的慢病毒載體（廣州銳博生物科技有限公司）；SYBR Green Real-time PCR （上海索萊寶生物公司）；IL-4、IL-17 ELISA試劑盒（美國R＆D公司）；大鼠抗Gr1、Ecp、GAPDH單克隆抗體（美國Abcam公司）；大鼠抗MBD2單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；辣根過氧化酶（HRP）標記的山羊抗大鼠IgG（廣州晶彩生物公司）；HE染色試劑盒（江蘇碧云天生物公司）；RT-PCR引物由上海生工合成；其余均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 小鼠哮喘模型的制備及分組 根據隨機數字表法將雌性WT小鼠與CD4CreMBD2fl/fl隨機分為 4組，分別記為WT生理鹽水組，WT哮喘組，CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組，CD4CreMBD2fl/fl哮喘組，每組10只。參考既往文獻［9］方法，使用如下方法構建哮喘小鼠模型：將含有100 μg HDM、100 μg OVA、15 μg LPS、2 mg氫氧化鋁的200 μl生理鹽水于第0、1、2天經腹腔注射至WT哮喘組和CD4CreMBD2fl/fl哮喘組小鼠體內進行致敏，并于第14、15、18和19天時，使用6%OVA液霧化上述小鼠30 min后在鼻內注射10 μg/μl的HDM進行激發。WT生理鹽水組和CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組小鼠僅使用生理鹽水進行致敏及刺激，處理方法及時間與哮喘組一致。認真觀察并記錄所有小鼠在實驗期間的行為改變，如呼吸節奏的改變、打噴嚏的頻率，情緒是否易怒、躁動等，大小便有無失禁，是否出現易疲倦、嗜睡等哮喘相關癥狀樣改變。所有實驗小鼠均于第21天時處死。

1.2.2 氣道高發反應（airway hyperreactivity，AHR）檢測 參考文獻［9］方法在第21天時（即最后一次激發的24 h）通過Buxco肺功能直接容積描記儀檢測Mch誘導下的氣道阻力變化，步驟如下：應用10%的水合氯醛麻醉小鼠，切開氣管進行插管，首先測定肺阻力基線值1 min，然后予以10 μl生理鹽水及濃度呈遞增趨勢（0.39、0.78、1.56、3.12 mg/ml） 10 μl Mch進行刺激氣道，再次記錄肺阻力值。取各組小鼠各個刺激物質及濃度的平均值進行分析計算并繪制小鼠氣道反應曲線，以表示AHR的高低。

1.2.3 肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）的收集 根據文獻［10］方法收集BALF，處死小鼠后，切開小鼠氣管并插入氣管導管，暴露肺臟，摘取小鼠左肺并用絲線結扎斷端后，向導管內注入0.5 ml無菌生理鹽水灌洗右肺并回收BALF，重復 3次。將收集的BALF于4 ℃、3 000 r/min 離心15 min，收集上清液，-20 ℃保存備用。取離心后的底層沉淀，經紅細胞裂解，并按上述方法進行離心2次后，使用血細胞儀測定BALF中的細胞總數。使用 Biping沉降系統制作細胞切片，HE染色后對200個BALF細胞進行中性粒細胞（neutrophile，NEU）和嗜酸性細胞（eosinophils，EOS）計數。

1.2.4 肺組織病理學觀察 將1.2.3摘取的左肺組織固定于10%甲醇溶液中，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片至5 μm后固定，蘇木素-伊紅（HE）染色后，光鏡下觀察肺組織病理學改變。

1.2.5 脾臟T細胞的分離、活化及流式分析 小鼠處死后，于無菌條件下取脾臟，PBS充分沖洗后，采用70 μm孔的尼龍網將其切碎，200目不銹鋼濾網過濾后，收集細胞懸液，300 g離心10 min，取上清液進行細胞因子檢測，PBS重懸底層細胞沉淀，利用Ficoll密度梯度離心法分離小鼠脾臟中的單個核細胞。參考CD4+T細胞磁珠分選試劑盒說明方法利用陽選法分選各組小鼠脾臟單個核細胞中的CD4+T細胞，計數后，接種至12孔板中，并應用含50 ng/ml PMA、1 μg/ml 離子霉素和3 μg/ml 莫能菌素，1% 青鏈霉素，10%FBS的RPMI1640于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中刺激、活化細胞5 h。PBS洗滌細胞后，再調整細胞密度至1×105個/ml加入流式管，加入FITC-CD4于4 ℃避光孵育30 min后，再加入100 μl細胞固定/破膜液，于室溫下避光孵育30 min，300 g離心10 min后分別加入PE-IL-4與APC-IL-17試劑，并于4 ℃避光孵育30 min。對照管分別加入各色的同型對照抗體。每管加入適量PBS，再次離心后，加入0.5 ml多聚甲醛重懸細胞，300目濾膜過濾細胞團塊后，流式細胞儀檢測。實驗單獨重復3次。

1.2.6 ELISA實驗 按照ELISA試劑盒說明方法檢測小鼠BALF中IL-4與IL-17表達水平；將各組小鼠脾臟分離的CD+T細胞，聯合使用160 ng/ml PMA、4 μg/ml的離子霉素刺激6 h后，使用ELISA檢測 IL-4與IL-17的表達。

1.2.7 siRNA慢病毒載體的體外感染 參考文獻［9］方法，使用免疫磁珠分選小鼠脾臟na?ve CD4+T細胞，按1×105個/孔密度接種至包被CD3/CD28抗體的12孔板，使用含10 U/ml IL-2的RPMI1640刺激48 h后，去除培養基，使用含10%FBS的RPMI1640培養基重懸細胞，并將其分為3組，si-NC組，si-MBD2組和Control組。其中si-NC組與si-MBD2組的慢病毒感染操作如下：取約2×106個細胞懸液置于流式管中，加入6 μg/ml polybrene，使用si-MBD2和陰性對照慢病毒載體si-NC以感染復數MOI=20進行感染CD4+T細胞，并在室溫下800 r/min離心4 h以提高干擾效率。

1.2.8 Th2與Th17細胞的分化和流式分析 取1.2.7中3組約1×106個CD4+T細胞，接種至包被CD3/CD28抗體的培養皿，加入含10 ng/ml IL-4、30 U/ml IL-2、2 000 ng/ml 可溶性CD28、5 000 ng/ml IFN-γ抗體、10%FBS和1%青鏈霉素RPMI1640進行Th2的定向誘導分化6 d，隔日更換培養液，隨后按上述條件進行破膜，加入PE-IL-4，PBS洗滌細胞2次后，加入0.5 ml多聚甲醛重懸細胞，按1.2.5方法處理細胞后上機檢測。Th17細胞定向誘導分化步驟如下：按上述方法進行接種已包被CD3/CD28抗體后，加入含5 ng/ml TGF-β、 20 ng/ml IL-1β、20 ng/ml IL-6、10 ng/ml IL-21和10 μg/ml IL-4與IFN-γ抗體、10%FBS和1%青鏈霉素的RPMI1640進行Th17定向誘導分化6 d，進行換液、破膜，最后加入APC-IL-17上機檢測。實驗單獨重復3次。

1.2.9 RT-PCR實驗 按照TRIzol法提取各組小鼠脾臟中分離的CD4+T細胞中的總RNA，分光光度計檢測RNA純度與濃度。利用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，根據SYBR Green Real-time PCR試劑說明書及預實驗確定的反應時間與溫度進行實時定量PCR。RT-PCR引物序列為：MBD2正向引物5'-CCCAGCGGATGAATGAACAAC-3＇，反 向 引 物 5'-CTGGACCGACTCCTTGAAGACC-3'；RORγt正向引物5'-AGTGTAATGTGGCCTACTCCTGAPDH-3'，反向引物5'-GCTCCTGTTGCAGTTGTTTCT-3'；GATA3正向引物5＇-ACACTCTGGAGGAGGAATGCCAAT-3＇，反向引物5＇-TTCGGTTTCTGGTCTGGATGCCTT-3＇；GAPDH正 向 引 物5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，反向引物5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。以GAPDH為待測miRNA或mRNA的內參，采用2-ΔΔCt方法分析。上述實驗單獨重復3次。

1.2.10 Western blot實驗 取各組小鼠待測組織，加入RIPA細胞裂解液及蛋白酶抑制劑提取組織中總蛋白。BCA法進行蛋白定量，按照1∶4向上清液中加入5×上樣緩沖液，并于沸水中加熱變性10 min。取30 μg蛋白進行SDS-PAGE分離蛋白，采用濕轉法將分離蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶于室溫下封閉2 h后，分別加入MBD2（1∶300）、Gr1（1∶300）、ECP（1∶300），β-actin （1∶1 000）一抗，4 ℃搖床孵育過夜。TBST溶液清洗3次，5 min/次，以辣根酶標記的二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST溶液清洗3次。均勻滴加ECL發光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照。Image J軟件測定條帶灰度值，以目標蛋白與內參β-actin的比值作為其相對含量。以上實驗單獨重復3次。

1.3 統計學分析 采用統計學軟件SPSS19.0和 GraphPad Prism 5.0進行統計分析，符合正態分布的計量資料數據用±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）的Dunnett's或Bonferroni's多重比較進行分析，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MBD2在各組小鼠中的表達 RT-PCR與Western blot實驗結果顯示，與WT生理鹽水組小鼠相比，CD4CreMBD2fl/fl小鼠脾臟CD4+T細胞中MBD2 mRNA及蛋白表達均顯著降低（P＜0.01），而WT哮喘組小鼠脾臟CD4細胞中MBD2 mRNA及蛋白表達均明顯增加（P＜0.05，圖1）。

圖1 MBD2在各組小鼠中的表達Fig.1 Expression level of MBD2 of mice in each group

2.2 MBD2缺陷改善小鼠哮喘癥狀 小鼠的一般情況觀察顯示，WT哮喘組在刺激后的第4天開始出現精神萎靡、嗜睡等癥狀，而CD4CreMBD2fl/fl哮喘組在刺激后的第5天開始出現躁動、呼吸加快與易疲倦等現象，WT生理鹽水組與CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組小鼠精神狀態正常，無上述相關癥狀。肺功能檢測結果顯示，與WT生理鹽水組或CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組相比，WT哮喘組與CD4CreMBD2fl/fl哮喘組的氣道反應性明顯增加（P＜0.05），但WT哮喘組具有較高的基線值，其在低劑量Mch刺激下即氣道阻力明顯增加，且隨著Mch濃度的增加，氣道反應性升高趨勢較CD4CreMBD2fl/fl哮喘組更為顯著（P＜0.05），WT生理鹽水組與CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組差異無統計學意義（P＞0.05，圖2）。

圖2 各組小鼠氣道阻力變化Fig.2 Changes of airway resistance of mice in each group

BALF細胞分類計數結果顯示，與WT生理鹽水組或CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組小鼠相比，WT哮喘組與CD4CreMBD2fl/fl哮喘組BALF中的細胞總數、中性粒細胞和嗜酸性細胞均顯著增加（P＜0.05），前兩組無明顯差異（P＞0.05）；而與WT哮喘組相比，CD4CreMBD2fl/fl哮喘組BALF中的細胞總量、中性粒細胞均明顯降低（P＜0.05），嗜酸性細胞明顯增加（P＜0.05，圖3）。

圖3 各組小鼠BALF中細胞總數與成分Fig.3 Total number of cells and components in BALF of each group of mice

肺組織病理學染色結果顯示，WT哮喘組小鼠肺組織的支氣管黏膜充血水腫，管腔狹窄，其內可見黏液栓形成，黏膜上皮細胞出現大量壞死脫落，氣道、肺間質和血管周圍浸潤大量炎癥細胞；而CD4CreMBD2fl/fl哮喘組肺組織損傷明顯減輕，浸潤的炎癥細胞顯著減少；WT生理鹽水組與CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組小鼠肺組織結構正常，管腔通暢，氣道黏膜上皮細胞完整，肺間質無明顯炎癥細胞浸潤。ELISA檢測BALF中細胞因子結果顯示，與WT生理鹽水組小鼠相比，WT哮喘組與CD4CreMBD2fl/fl哮喘組小鼠脾臟中IL-17、IL-4均顯著增加（P＜0.01），CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組IL-4明顯增加（P＜0.05）；而與WT哮喘組相比，CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組上述細胞因子均顯著降低（P＜0.01），而CD4CreMBD2fl/fl哮喘組小鼠IL-17明顯減少（P＜0.05），但IL-4顯著增加（P＜0.05）；Western blot實驗結果顯示，與WT生理鹽水組或CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組相比，WT哮喘組和CD4CreMBD2fl/fl哮喘組小鼠肺組織內中性粒細胞顯著增加（P＜0.05），且與WT哮喘組相比，CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組和CD4CreMBD2fl/fl哮喘組的中性粒細胞升高趨勢明顯降低（P＜0.05）；與WT生理鹽水組相比，WT哮喘組，CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組及CD4CreMBD2fl/fl哮喘組小鼠肺組織內的嗜酸性細胞顯著增加（P＜0.05），而與WT哮喘組相比，CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組小鼠肺組織內的嗜酸性細胞明顯降低（P＜0.05），CD4CreMBD2fl/fl哮喘組差異無統計學意義（P＞0.05，圖4A，B）。

圖4 各組小鼠肺組織病理學改變和肺組織中浸潤的炎癥因子與細胞檢測Fig.4 Pathological changes of lung tissue and inflammatory factors and cells in lung tissue of mice in each group

2.3 MBD2缺陷對哮喘小鼠體內Th2與Th17表達的影響 流式細胞術、RT-PCR和ELISA結果顯示，與WT生理鹽水組小鼠相比，WT哮喘組與CD4CreMBD2fl/fl哮喘組小鼠脾臟中Th17、Th2細胞比例，RORγt與GATA3 mRNA，IL-17和IL-4細胞因子均顯著增加（P＜0.05），CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組Th2細胞比例、GATA3 mRNA和IL-4細胞因子均明顯增加（P＜0.05）；而與WT哮喘組相比，CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組及哮喘組小鼠以Th2細胞及相關細胞因子占主要優勢，即Th2細胞比例、GATA3 mRNA和IL-4細胞因子均明顯增加（P＜0.05，圖5）。

圖5 MBD2缺陷促進哮喘小鼠體內Th2細胞表達Fig.5 MBD2 deficiency promotes Th2 expression in asthmatic mice

2.4 沉默MBD2對小鼠na?ve CD4+T細胞Th2與Th17分化的影響 RT-PCR檢測慢病毒載體感染后小鼠na?ve CD4+T細胞中MBD2 mRNA的表達水平，結果顯示，與Control組相比，si-MBD2組中MBD2mRNA的表達水平明顯降低（P＜0.05），si-NC組差異無統計學意義（P＞0.05）。流式細胞術檢測Th2與Th17的分化結果顯示，與Control組相比，si-MBD2組中Th2細胞比例顯著增加（P＜0.05），而Th17細胞比例明顯降低（P＜0.05），si-NC組差異無統計學意義（P＞0.05，圖6）。

圖6 沉默MBD2在體外調控Th2與Th17細胞的分化Fig.6 Silencing MBD2 regulates differentiation of Th2 and Th17 cells in vitro

3 討論

本課題組前期工作發現小鼠脾臟CD4+T細胞在經刺激分化后，細胞中MBD2的表達水平顯著升高。同時，通過對比哮喘患者與健康人群外周血的研究證實，CD4+T細胞中MBD2在哮喘患者體內同樣存在高表達現象，這提示MBD2可能與哮喘的免疫發病機制及CD4+T的分化密切相關［7］。而MBD2作為表觀遺傳調控元件，既往研究表明其能夠通過甲基化Tbet/HIx誘導T細胞向Th17細胞分化，從而參與哮喘，尤其是重型哮喘的發病過程［11］。Th17細胞是CD4+T細胞的重要組成部分，維甲酸相關孤核受體γt（retinoid-related orphan nuclear receptor γt，RORγt）是Th17細胞分化的關鍵轉錄調控因子［12］。與Th2細胞產生以IL-4為主的細胞因子相比，Th17細胞主要通過產生IL-17招募中性粒細胞浸潤至氣道，且其誘發的哮喘類型不易受到糖皮質激素的抑制［13］。這也進一步證實臨床上對激素治療產生抵抗的哮喘類型多以Th17介導中性粒細胞炎癥為主［14］。

本研究通過HDM聯合OVA與LPS在特異性敲除CD4+T細胞中MBD2基因表達的小鼠體內構建哮喘模型，與既往文獻證實的結果一致，即該條件誘導的哮喘模型主要以中性粒細胞浸潤為主［15］。在驗證MBD2在各組小鼠中的mRNA與蛋白表達后，小鼠行為學改變、Mch激發的氣道高反應試驗和肺組織病理學染色均證實哮喘小鼠模型的成功建立。BALF細胞類型分析及細胞因子檢測的結果表明，在野生型小鼠哮喘中以中性粒細胞及IL-17炎癥因子占主導地位，這與NEWCOMB等［16］學者研究發現IL-17表達增加與中性粒細胞浸潤為主的哮喘具有相關性的結果一致。而在MBD2基因缺陷的小鼠哮喘模型中，肺組織損傷明顯減輕，且以嗜酸性粒細胞與IL-4相關的炎癥反應占主要地位。COOK等［17］學者在研究樹突狀細胞活化機制中發現MBD2的缺失可導致CD4+T細胞向Th2細胞分化，而抑制其向Th17細胞分化，進一步的研究表明MBD2可調控Th2細胞及相關細胞因子的表達，從而下調初始CD4+T細胞向該方向的分化水平。這說明MBD2可能是調控Th2與Th17的關鍵環節。本研究為進一步明確MBD2在哮喘疾病過程中是否同樣發揮上述作用，再次通過流式細胞術、RT-PCR及ELISA實驗檢測各組小鼠脾臟中Th2與Th17及相關細胞因子的表達，結果表明在MBD2基因缺陷的哮喘小鼠中，Th17細胞的表達、分化及相關細胞因子的分泌均較野生型哮喘小鼠顯著降低，而Th2細胞及其相關細胞因子的表達均顯著增加，且對體外分離的na?ve CD4+T細胞進行靶向沉默MBD2基因表達進一步證實了MBD2基因能夠通過調控Th2與Th17細胞的分化，在哮喘發生的免疫機制中發揮重要作用。

綜上，本研究表明可通過促進Th2細胞及IL-4細胞因子表達敲除CD4+T細胞中MBD2基因表達，抑制Th17細胞及IL-17的表達從而改善以中性粒細胞浸潤為主的重癥哮喘。然而，MBD2作為重要的甲基化調節蛋白，其在免疫細胞中廣泛表達，前期雖研究證實MBD2能夠通過調控相關基因影響Th2/Th17細胞的分化，但Th細胞的發育、分化等生物學過程涉及眾多分子與蛋白，MBD2能否通過調節其他基因表達而參與哮喘的發生發展尚不得而知，后續將進一步通過基因芯片等技術對比分析CD4+T細胞中MBD2基因缺陷的哮喘小鼠中差異表達的基因驗證其在哮喘發病過程中的作用，以期進一步闡明哮喘發生的免疫學機制，并且MBD2有望成為哮喘的新型臨床標志物和治療靶點。