二甲雙胍調節mTOR/HIF-1α通路對子癇前期大鼠免疫反應的影響及作用機制

魯小紅 黃麗瓊 賀 藝 瞿小祥 （咸寧市中心醫院產科，咸寧437100）

子癇前期（pre-eclampsia，PE）是一種妊娠特異性的、免疫介導的綜合征，其特征是高血壓發作，并在妊娠20周后常常伴有尿蛋白增加［1］。免疫在PE發生中起到關鍵作用，研究顯示蛻膜中的免疫細胞主要由蛻膜自然殺傷細胞和T細胞（約10%）等組成，研究顯示Th17細胞水平的升高和Treg水平的降低會影響滋養層細胞侵襲和血管生成［2-3］。免疫細胞的分化受到哺乳動物雷帕霉素受體（mammalian target of rapamycin，mTOR）的調控，mTOR可通過調節缺 氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α） 的表達調節免疫細胞的分化［4］。mTOR/HIF-1α可以通過調節滋養細胞侵襲和遷移參與PE的發生，但是該通路是否可通過調節免疫水平參與PE尚不明確。最新有研究發現二甲雙胍可以治療妊娠糖尿病，并且具有預防PE的作用，但是其機制仍不清楚［5-6］。本文主要基于mTOR/HIF-1α途徑探討二甲雙胍對PE的影響以及對免疫水平的影響，為臨床更好地治療PE提供基礎實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級SD大鼠（雌性和雄性，240～260 g，8～12周，南京醫科大學動物中心，中國）；L-硝基精氨酸甲酯（Q110297，上海雅吉生物，中國）；無創血壓檢測系統（Kent Scientific公司，美國）；二脲試劑（HPBIO-R1253，鵬派生物技術公司，中國）；生化試劑盒（Neyotime公司，中國）；標準Ficoll Hypaque梯度離心試劑（Axis Shield公司，英國）；蛋白質轉運抑制劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，美國）；CD4+、CD25、FOXP3和IL-17抗體以及BD Aria IIY熒光活細胞分選儀（BD公司，美國）；RNAspin Mini試劑盒（GE Healthcare，美國）；Bestar qPCR RT和BestarTMqPCR試劑盒（DBI Bioscience公司，德國）；Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統（Santa公司，美國）；免疫組化染色IL-17抗體、FOXP3抗體和二抗（ab168194，ab75763）、一抗和山羊抗兔HRP-IgG二抗（ab205718，Abcam公司，美國）；PVDF膜（JS0344，JSENB公司，中國香港）；ECL顯色試劑盒（Thermo Fisher公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、建模和干預 使大鼠適應環境 1周，并置于25～26 ℃通風良好的籠中，相對濕度為50%～70%，定期進行紫外線消毒，在6：00 至18：00 進行光照，并自由攝入食物和水。將大鼠交配（雌性∶雄性2∶1），并在第2天早晨收集陰道涂片置于顯微鏡下觀察。在涂片上觀察到精子存在的日期為妊娠第0天。在妊娠第5天至第10天，將總共45只妊娠大鼠隨機分為對照組、PE組和PE+二甲雙胍組（n=15）。從妊娠第10天開始，PE組和PE+二甲雙胍組大鼠連續皮下注射劑量為250 mg/（kg·d）的L-硝基精氨酸甲酯構建PE模型，連續7 d［7］。對照組大鼠注射等體積的生理鹽水。PE+二甲雙胍組大鼠在妊娠第10 天通過二甲雙胍灌胃，劑量為200 mg/（kg·d），連續7 d。

1.2.2 觀察指標及方法

1.2.2.1 血壓檢測 在妊娠的第9天和第18天，通過尾氣袖帶法使用無創血壓檢測系統測量大鼠的收縮壓。血壓測量在上午8：00進行，在測量前將大鼠禁食2 h，在測量前測量器置于預熱的恒溫器（37 ℃）中10 min。隨后，在測量過程中，將室溫保持在25 ℃。使用預調節的尾袖裝置在大鼠心律穩定時將夾子置于大鼠尾巴的根部，以測量大鼠的血壓。測量每只大鼠的血壓3次，取其平均值。

1.2.2.2 24 h尿蛋白 在妊娠第9天和第18天從每組大鼠中收集尿液，在717 g和4 ℃下將尿液離心10 min去除沉淀物。將縮二脲試劑添加到尿液樣本中以檢測24 h尿蛋白。

1.2.2.3 免疫組化染色檢測蛻膜組織中免疫細胞浸潤 通過免疫組化染色檢測子宮蛻膜組織中Th17細胞標志蛋白IL-17評估Th17細胞浸潤情況［8］，通過檢測Treg細胞標志蛋白叉頭樣轉錄因子 （FOXP3）評估Treg細胞浸潤情況。將蛻膜組織用4%的聚甲醛固定并用梯度乙醇脫水，包埋在石蠟中，制成厚度為5 μm的組織玻片標本，將切片置于-20 ℃的冷丙酮中固定15 min。然后在37 ℃下分別與抗大鼠IL-17和FOXP3抗體孵育1 h，然后加入二抗進行顯色，最后利用蘇木精復染細胞核，棕色和黃色染色代表陽性細胞。隨機選擇5個高倍視野，Th17細胞和Treg細胞比例（%）=IL-17或FOXP3陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.2.2.4 流式細胞術檢測Th17和Treg細胞比例 大鼠處死前抽取尾靜脈血液，通過標準Ficoll Hypaque梯度離心試劑分離外周血單個核細胞。將所得的單個核細胞用磷酸鹽緩沖液以500 μg/g洗滌兩次，每次持續5 min。通過磁激活細胞分選試劑從外周血單個核細胞中分離出CD4+T細胞。為了分析Treg細胞，單個核細胞通過與大鼠抗CD25（5 μg/ml）和抗大鼠FOXP3（5 μg/ml）在黑暗中孵育20 min進行表面標記染色。為了分析Th17細胞，在24孔板中用含有蛋白質轉運抑制劑的細胞刺激混合物孵育4 h。然后將細胞收獲至5 μl的無菌試管中，洗滌后加入大鼠抗CD4（5 μg/ml）和抗大鼠IL-17（5 μg/ml）在黑暗中孵育20 min進行表面標記染色。使用BD Aria Ⅱ活細胞分選儀對細胞進行分析。

1.2.2.5 RT-qPCR 使用RNAspin Mini試劑盒從收集到的CD4+T細胞中提取RNA，然后使用Bestar qPCR RT試劑盒將其逆轉錄為cDNA，條件如下：37 ℃ /15 min；98 ℃ /5 min。使用BestarTMqPCR預混液進行qPCR實驗，條件如下：95 ℃/2 min， 94 ℃/20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃/20 s，40個循環，最后在72 ℃下延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統進行RT-qPCR分析。mTOR正向引物：5'-ATGACGAGACCCAGGCTAAG-3'，反 向 引 物：5'-GCCAGTCCATGCCATCAG-3'；HIF-1α正 向 引 物：5'- GTTTACTAAAGGACAAGTCACC-3'，反向引物：5'- TTCTGTTTGTTGAAGGGAG-3'；GAPDH正向引物：5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3'，反向引物：5'- CAAAGTTGTCATGGATGHACC-3'。GAPDH作為內源參照，通過比較循環閾值評估mRNA水平。

1.2.2.6 Western blot 將CD4+T細胞裂解后提取總蛋白并檢測濃度。然后分別取總量為40 μg的總蛋白進行分離，分離條件為10%的聚丙烯酰胺凝膠、80～120 V、90 min。濕法轉膜，在100 mV下將分離的蛋白轉移到PVDF膜上。將一抗稀釋500倍后分別加入膜中并在4 ℃下孵育過夜。洗滌后加入山羊抗兔HRP-IgG二抗室溫孵育1 h。本研究內參為GAPDH，分析目標蛋白條帶相對于GAPDH的灰度值分析蛋白表達水平。

1.3 統計學處理 數據以±s表示。統計分析使用SPSS19.0軟件。組間比較分別使用方差檢驗和SNK-q檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 二甲雙胍對PE大鼠收縮壓的影響 妊娠第 9天三組小鼠血壓均正常（P＞0.05）。在妊娠第18天三組的血壓比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。PE組的收縮壓（148.23±11.96） mmHg和舒張壓（104.42±9.67） mmHg均顯著高于對照組（P＜0.05），PE+二甲雙胍組的收縮壓（128.74±10.35） mmHg和舒張壓（91.28±8.61） mmHg均顯著低于PE組（P＜0.05），見表1。

表1 二甲雙胍對PE大鼠血壓的影響（±s，n=15，mmHg）Tab.1 Effect of metformin on blood pressure of PE rats （±s，n=15，mmHg）

表1 二甲雙胍對PE大鼠血壓的影響（±s，n=15，mmHg）Tab.1 Effect of metformin on blood pressure of PE rats （±s，n=15，mmHg）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs PE group.

2.2 二甲雙胍對PE大鼠24 h尿蛋白的影響 在妊娠第9天各組大鼠24 h尿蛋白均為0.09 g左右，處于正常范圍。在妊娠第18天三組的24 h尿蛋白比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。PE組的24 h尿蛋白0.145±0.013 g顯著高于對照組（P＜0.05），PE+二甲雙胍組的24 h尿蛋白（0.118±0.011 g顯著低于PE組（P＜0.05），見表2。

表2 二甲雙胍對PE大鼠24 h尿蛋白的影響（±s，n=15， g/24 h）Tab.2 Effect of metformin on 24 h urine protein in PE rats（±s，n=15，g/24 h）

表2 二甲雙胍對PE大鼠24 h尿蛋白的影響（±s，n=15， g/24 h）Tab.2 Effect of metformin on 24 h urine protein in PE rats（±s，n=15，g/24 h）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs PE group.

2.3 二甲雙胍對PE大鼠胎盤蛻膜組織中Th17和Treg細胞浸潤的影響 如圖1所示，藍色為染色的細胞核，棕色為IL-17或FOXP3陽性細胞。結果顯示，三組PE大鼠胎盤蛻膜組織中Th17和Treg細胞浸潤情況比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。PE組的Th17細胞比例（14.36±1.53）%和Th17/Treg比值（13.81±1.21）顯著高于對照組，Treg比例（1.04±0.12）%顯著低于對照組（P＜0.05）。PE+二甲雙胍組 的Th17細 胞 比例（9.83±1.06）%和Th17/Treg（4.31±0.45）顯 著 低 于PE組，Treg比 例（2.28±0.31）%顯著高于PE組（P＜0.05）。見表3。

表3 二甲雙胍對PE大鼠胎盤蛻膜組織中Th17和Treg細胞浸潤的影響（±s，n=15）Tab.3 Effect of metformin on Th17 and Treg cell infiltration in placenta and decidua of PE rats （±s，n=15）

表3 二甲雙胍對PE大鼠胎盤蛻膜組織中Th17和Treg細胞浸潤的影響（±s，n=15）Tab.3 Effect of metformin on Th17 and Treg cell infiltration in placenta and decidua of PE rats （±s，n=15）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs PE group.

圖1 免疫組化染色檢測二甲雙胍對PE大鼠胎盤蛻膜組織中Treg細胞和Th17細胞浸潤的影響（×200）Fig.1 Immunohistochemical staining to detect effect of metformin on infiltration of Treg cells and Th17 cells in placenta and decidua of PE rats （×200）

2.4 二甲雙胍對PE大鼠Th17和Treg細胞分化的影響 如圖2所示，CD4+IL17+為Th17細胞。CD25+FOXP3+為Treg細胞。三組大鼠外周血中Th17和Treg細胞比例比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。PE組的Th17細胞比例（1.94±0.21）%和Th17/Treg（0.64±0.07）顯著高于對照組，Treg比例（3.02±0.36）%顯著低于對照組（P＜0.05）。PE+二甲雙胍組的Th17細胞比例（1.53±0.16）%和Th17/Treg（0.36±0.04）顯著低于PE組，Treg比例（4.21±0.51）%顯著高于PE組（P＜0.05）。見表4。

表4 二甲雙胍對PE大鼠Th17和Treg細胞分化的影響 （±s，n=15）Tab.4 Effect of metformin ondifferentiation of Th17 and Treg cells in PE rats （±s，n=15）

表4 二甲雙胍對PE大鼠Th17和Treg細胞分化的影響 （±s，n=15）Tab.4 Effect of metformin ondifferentiation of Th17 and Treg cells in PE rats （±s，n=15）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs PE group.

圖2 流式細胞術檢測二甲雙胍對PE大鼠Th17細胞分化的影響Fig.2 Flow cytometry detection of effect of metformin on differentiation of Th17 cells in PE rats

2.5 二甲雙胍對PE大鼠mTOR和HIF-1α mRNA表達水平的影響 三組的mTOR/HIF-1α 通路中基因轉錄水平比較差具有統計學意義（P＜0.05）。PE組的mTOR和HIF-1α mRNA顯著高于對照組（P＜0.05），PE+二甲雙胍組的mTOR和HIF-1α mRNA水平顯著低于PE組（P＜0.05），見表5。

表5 二甲雙胍對PE大鼠mTOR和HIF-1α mRNA表達水平的影響（±s，n=15）Tab.5 Effect of metformin on expression levels of mTOR and HIF-1α mRNA in PE rats （±s，n=15）

表5 二甲雙胍對PE大鼠mTOR和HIF-1α mRNA表達水平的影響（±s，n=15）Tab.5 Effect of metformin on expression levels of mTOR and HIF-1α mRNA in PE rats （±s，n=15）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs PE group.

2.6 二甲雙胍對PE大鼠mTOR/HIF-1α通路中蛋白表達水平的影響 三組的mTOR/HIF-1α通路中蛋白表達水平比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。PE組的mTOR和HIF-1α蛋白水平顯著高于對照組（P＜0.05），PE+二甲雙胍組的mTOR和HIF-1α蛋白水平顯著低于PE組（P＜0.05），見圖3、表6。

圖3 Western blot檢測二甲雙胍對PE大鼠mTOR和HIF-1α蛋白表達水平的影響Fig.3 Western blot detection of effect of metformin on expression of mTOR and HIF-1α protein in PE rats

表6 二甲雙胍對PE大鼠mTOR和HIF-1α蛋白表達水平的影響（±s，n=15）Tab.6 Effect of metformin on expression level of mTOR and HIF-1α protein in PE rats （±s，n=15）

表6 二甲雙胍對PE大鼠mTOR和HIF-1α蛋白表達水平的影響（±s，n=15）Tab.6 Effect of metformin on expression level of mTOR and HIF-1α protein in PE rats （±s，n=15）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs PE group.

3 討論

PE是孕產婦病死和發病的主要原因，給醫療保健系統帶來了沉重負擔。據估計，全球PE的患病率約為所有妊娠婦女的5%～8%，在發展中國家可能更高［9］。PE是孕產婦和產前病死和發病的主要原因，并且目前臨床上缺乏有效的治療方法。二甲雙胍是雙胍類抗糖尿病，可防止肝臟糖異生并增加外周組織對胰島素的敏感性［10］。近年來研究顯示二甲雙胍在產科中廣泛應用。研究證明二甲雙胍可有效治療妊娠糖尿病，并可能預防PE［11］。但是二甲雙胍對PE發展的影響隨機試驗尚待進行。

蛻膜中的免疫細胞主要由蛻膜自然殺傷細胞、Th17、Treg、巨噬細胞等組成。這些細胞分泌的各種免疫細胞和細胞因子參與調節滋養細胞的侵襲、血管生成和螺旋動脈重塑并誘導免疫耐受［12-13］。但是二甲雙胍是否可以調節PE免疫仍不清楚。本研究結果提示二甲雙胍可以顯著抑制PE大鼠的血壓，降低尿蛋白水平。此外，PE模型大鼠胎盤蛻膜組織中Th17細胞比例升高而Treg細胞比例明顯降低，二甲雙胍可以調節Th17/Treg平衡。Th17細胞會分泌促炎因子從而誘發免疫炎癥反應導致血壓升高和影響胎盤植入，Treg細胞會拮抗Th17功能，并起到免疫抑制作用，參與免疫耐受［14-15］。妊娠高血壓是PE的重要誘因，一項薈萃分析結果顯示二甲雙胍可以有效抑制血壓升高，并對PE具有緩解作用［16］。研究顯示二甲雙胍可能通過抑制Th17誘導的炎癥反應改善自噬和線粒體功能，從而緩解糖尿病相關炎癥［17］。二甲雙胍也可以通過調節Treg細胞減少脾臟生發中心的形成來減輕博來霉素誘導的硬皮病［18］。LEE等［19］研究結果顯示二甲雙胍可抑制T細胞增殖并抑制Th1和Th17細胞分化，并可劑量依賴性方式促進Treg的水平，從而緩解自身免疫性胰島炎。這提示二甲雙胍可能通過提高胎盤組織中Treg細胞水平，減少Th17細胞浸潤，從而恢復母體對胎盤的免疫耐受，緩解PE。

為進一步分析二甲雙胍緩解PE以及免疫細胞浸潤的機制，實驗檢測了外周血中Th17和Treg的水平，以及CD4+細胞中mTOR/HIF-1α通路的表達水平。胎盤組織中的免疫細胞浸潤來源于外周血，而外周血的T細胞分化受到mTOR/HIF-1α通路的調控，研究提示mTOR會激活HIF-1α的轉錄活性，進而調控基因轉錄水平誘導T細胞向Th17細胞分化，并減少Treg細胞的生成［20-21］。本次研究結果顯示二甲雙胍可使PE大鼠外周血中Th17/Treg平衡向Treg移動，并抑制T淋巴細胞中mTOR和HIF-1α的轉錄和翻譯水平。研究顯示二甲雙胍可以通過抑制mTOR/HIF-1α途徑抑制口腔鱗狀細胞癌的增殖和運動能力［22］。二甲雙胍也可以通過抑制mTOR/HIF-1α 通路水平調節肝細胞癌患者異常的代謝功能［23］。AL-HASHEM等［24］的研究結果表明二甲雙胍可通過抑制mTOR/HIF-1α軸緩解硫代乙酰胺誘導的肝組織纖維化和炎癥。這提示二甲雙胍可能通過抑制mTOR/HIF-1α通路減少T細胞向Th17細胞分化并促進Treg細胞分化，從而改善胎盤組織浸潤的Th17/Treg平衡，恢復母體和胎兒正常的免疫水平，從而緩解PE。

綜上所述，二甲雙胍可能通過抑制mTOR/HIF-1α通路緩解調控外周血和胎盤組織中Th17/Treg平衡，恢復免疫耐受水平，從而緩解PE。關于二甲雙胍對PE的治療作用、安全性和對胎兒的影響仍需要臨床試驗研究，并且其調控mTOR/HIF-1α通路的分子機制也需要進一步研究。