柚皮苷調控lncRNA MEG3/Wnt/β-catenin信號通路促進炎癥來源牙周膜干細胞的成骨分化

李生婷 姚毅章 趙國廷 （青海省第五人民醫院口腔醫學中心，西寧 810007）

牙周炎是由于牙菌斑中細菌侵犯牙周支持組織而引發的一種慢性炎癥，可造成牙周支持組織進行性破壞，最終導致牙齒松動脫落［1-2］。目前，隨著組織工程學、干細胞技術和分子生物學的快速發展，牙周組織再生工程技術已經成為牙周疾病治療的研究熱點［3］。人牙周膜干細胞（human periodontal ligament stem cell，hPDLSCs）是來源于牙周組織的間充質干細胞，具有自我更新能力和分化潛能，是牙周組織再生工程的關鍵種子細胞之一［4］。然而，研究表明炎癥微環境下hPDLSCs的成骨分化能力明顯降低［5-6］。因此尋找能夠改善炎癥環境下hPDLSCs的成骨分化能力的干預治療方法具有重要意義。

柚皮苷是從蕓香科植物柚、橘等果肉和果皮中提取的一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗病毒、抗菌等生物活性［7］。以往研究表明，柚皮苷對PDLSCs的成骨分化具有促進作用，可能在牙周疾病治療中具有一定應用［8-9］。但柚皮苷對炎癥狀態下PDLSCs的成骨分化能力的影響及其作用機制尚不完全清楚。本文主要研究體外分離牙周炎來源的牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells derived from periodontitis，PPDLSCs）和正常牙周組織來源的牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells obtained from healthy periodontal tissues，HPDLSCs），觀察柚皮苷對PPDLSCs成骨分化的影響，并探討其發揮作用的分子機制。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 收集在青海省第五人民醫院行前磨牙拔除術的35例牙周炎患者的前磨牙，其中男性21例，女性14例，年齡19～27歲，平均年齡（24.68±7.54）歲；另收集29例健康者的前磨牙，其中男16例，女13例，年齡18～25歲，平均年齡（22.98±7.64）歲；牙周炎患者和健康者的性別、年齡等一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.1.2 試劑 α-MEM培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；小干擾RNA（siRNA）陰性對照組和lncRNA MEG3 siRNA由廣州銳博生物科技有限公司合成；柚皮苷購自上海純優生物公司，純度≥98%，規格10 mg；β-甘油磷酸鈉購自美國Sigma公司；地塞米松購自北京索萊寶科技有限公司；SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購自常州百代生物科技有限公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；OCN、Runx2、ALP、GSK3β、p-GSK3β、β-catenin、β-actin一抗和辣根過氧化酶標記的二抗購自艾博抗（上海）貿易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 hPDLSCs分離培養 收集1.1.1的前磨牙用75%乙醇消毒后，PBS沖洗，用手術刀片刮取牙根中部1/3處的牙周膜組織，并剪成約1 mm×1 mm× 1 mm的小塊。分離培養PPDLSCs和HPDLSCs。將刮取的牙周膜組織塊以1 mm間距平鋪于25 ml培養瓶底部，無菌蓋玻片覆蓋組織塊，加入含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液的α-MEM細胞培養液，置于37 ℃，5%CO2的細胞培養箱中培養，待多數組織塊周圍有細胞游出后，去除蓋玻片，常規培養，每3 d更換1次培養液，待細胞生長至80%左右融合時傳代。取對數生長期的牙周膜細胞，采用有限稀釋法分離純化上HPDLSCs［10］：牙周膜細胞中加入EDTA胰酶消化吹散，制成單細胞懸液，常規細胞計數后，有限稀釋法將細胞接種于96孔板中，密度為1×103～3×103個/孔，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。培養5 d后置于顯微鏡下觀察細胞克隆形成，挑選并標記僅含有單個細胞克隆的培養孔，另補加100 μl的培養液繼續培養，待培養孔中細胞生長至占孔底面積的1/3～1/2時，含EDTA胰酶消化傳代。取第3代細胞進行后續培養。第4代人牙周膜細胞，采用磁珠分離法篩選牙周膜干細胞。

1.2.2 細胞瞬時轉染 將第5代培養的PPDLSCs細胞，以1×106個/孔接種至24孔板中，當細胞達80%融合時，將細胞分為兩組，一組轉染小干擾RNA（siRNA）陰性對照，記為si-RNA；一組轉染siRNA lncRNA MEG3，記為si-MEG3。轉染方法參照Lipofectamine 3000試劑說明書，轉染48 h后，實時熒光定量PCR檢測轉染效率。

1.2.3 MTT實驗 收集對數生長期的PPDLSCs細胞，調整細胞懸液濃度為5×103個/ml，以100 μl/孔接種于96孔板中，置于培養箱中培養，待細胞貼壁后，將細胞分組，并分別加入柚皮苷終濃度0、10、 100 nmol/L、1、10、100 μmol/L處理，分別于處理24 h、48 h和72 h時，每孔加入20 μl的MTT溶液，反應4 h后。終止培養，吸除培養孔中培養液，然后每孔加入150 μl二甲基亞砜溶液37 ℃孵育10 min，然后使用酶標儀檢測490 nm處吸光度值（OD490）。

1.2.4 成骨分化誘導 將正常培養的PPDLSCs及si-NC組、si-MEG3組的PPDLSCs，分別以5×104個/孔接種至6孔板中，常規培養24 h，至細胞達60%融合后，每孔加入1 μmol/L柚皮苷，以不加柚皮苷為對照，室溫孵育30 min后更換礦化誘導培養液（含10%胎牛血清、5 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/ml維生素C、1×10-8mol/L地塞米松的α-MEM培養液），繼續培養，每3 d更換1次培養液，成骨誘導第7天，棄去誘導培養液，沖洗并收集細胞，檢測成骨相關基因的表達。

1.2.5 RT-qPCR實驗 收集以上正常培養及處理后的HPDLSCs和PPDLSCs細胞，采用Trizol法提取總RNA，紫外分光光度法檢測RNA質量和濃度，然后逆轉錄為cDNA。利用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒進行定量PCR反應，分別以U6和GAPDH為內參，檢測lncRNA MEG3和成骨相關基因OCN、Runx2、ALPmRNA的相對表達水平。引物序列： lncRNA MEG3正向5'-TACACCTCACGAGGGCACTA-3'，反向5'-CAGGGCTTAATGCCCAATGC-3'；OCN正向5'-CTCACTCTGCTGGCCCTGAC-3'，反向5'-CCTTGTAGCCAGGCCCATTG-3'；Runx2正向5'-CCCGTGGCCTTCAAGGT-3'，反 向5'-CGTTACCCGCCATGACAGTA-3'；ALP正向5'-GGACCATTCCCACGTCTTCAC-3'，反 向5'-CCTTGTAGCCAGGCCCATTG-3'；U6正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向5'- AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；GAPDH正 向5'- CCGCATCTTCTTTTGCGTCG-3'，反 向5'-GGACTCCACGACGTACTCAG-3'。

1.2.6 Western blot實驗 收集處理后的PPDLSCs細胞，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白樣品濃度。將蛋白樣品放入沸水中變性，進行SDS-PAGE電泳，轉膜，采用5%脫脂奶粉室溫封膜1 h。參照一抗說明書稀釋一抗，加入稀釋后的一抗OCN（1∶1 000）、Runx2（1∶500）、ALP（1∶500）、GSK3β（1∶1 000）、 p-GSK3β（1∶1 000）、β-catenin（1∶1 000）、β-actin （1∶1 000），室溫孵育2 h，洗膜。加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化酶標記的二抗，放入搖床中孵育1 h，洗膜。加入化學發光液中顯色，顯微鏡下曝光，拍照。使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統計學分析 本研究數據統計分析采用SPSS19.0，性別等計數資料用%表示，mRNA相對表達量等計量資料用±s表示，兩兩比較采用LSD-t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析檢驗，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 柚皮苷促進PPDLSCs的增殖和成骨分化 本研究使用柚皮苷終濃度0、10、100 nmol/L、1、10、 100 μmol/L處理PPDLSCs，MTT實驗檢測細胞增殖情況，結果顯示，處理24 h時細胞增殖能力無明顯變化（P＞0.05），處理48 h和72 h時100 nmol/L和 1 μmol/L組細胞的吸光度值與對照組比較明顯升高（P＜0.05），而10 μmol/L和100 μmol/L組細胞的增殖能力受到明顯抑制（P＜0.05）。見表1。1 μmol/L柚皮苷處理對細胞增殖的促進作用最明顯，因此后續實驗采用柚皮苷1 μmol/L處理細胞。

表1 不同濃度柚皮苷對PPDLSCs細胞增殖的影響（±s）Tab.1 Effects of naringin at different concentrations on proliferation of PPDLSCs （±s）

表1 不同濃度柚皮苷對PPDLSCs細胞增殖的影響（±s）Tab.1 Effects of naringin at different concentrations on proliferation of PPDLSCs （±s）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs naringin 1 μmol/L group.

RT-qPCR結果顯示，與對照組比較，柚皮苷組PPDLSCs中OCN、Runx2和ALP mRNA相對表達量均升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；Western blot結果顯示，與對照組比較，柚皮苷組PPDLSCs中OCN、Runx2和ALP 蛋白相對表達量均升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖1、表2。

表2 對照組和柚皮苷組PPDLSCs中成骨分化相關基因的表達（±s）Tab.2 Expression of osteogenic differentiation related genes in PPDLSCs in control group and naringin group （±s）

表2 對照組和柚皮苷組PPDLSCs中成骨分化相關基因的表達（±s）Tab.2 Expression of osteogenic differentiation related genes in PPDLSCs in control group and naringin group （±s）

Note：1）P＜0.05 vs control group.

圖1 Western blot檢測OCN、Runx2和ALP蛋白表達Fig.1 Expressions of OCN， Runx2 and ALP were detected by Western blot

2.2 柚皮苷上調PPDLSCs中lncRNA MEG3的表達 RT-qPCR檢測HPDLSCs和PPDLSCs中lncRNA MEG3表達，結果顯示，與HPDLSCs比較，PPDLSCs中lncRNA MEG3相對表達量降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。與對照組比較，柚皮苷組 PPDLSCs中lncRNA MEG3相對表達量升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表3 lncRNA MEG3在PPDLSCs細胞中低表達（±s）Tab.3 lncRNA MEG3 was low expressed in PPDLSCs （±s）

表3 lncRNA MEG3在PPDLSCs細胞中低表達（±s）Tab.3 lncRNA MEG3 was low expressed in PPDLSCs （±s）

Note：1）P＜0.05 vs HPDLSCs group.

表4 柚皮苷上調lncRNA MEG3在PPDLSCs中的表達（±s）Tab.4 Naringin up-regulates expression of lncRNA MEG3 in PPDLSCs （±s）

表4 柚皮苷上調lncRNA MEG3在PPDLSCs中的表達（±s）Tab.4 Naringin up-regulates expression of lncRNA MEG3 in PPDLSCs （±s）

Note：1）P＜0.05 vs control group.

2.3 抑制lncRNA MEG3對PPDLSCs細胞增殖的影響 RT-qPCR結果顯示，與si-NC組比較，si-MEG3組PPDLSCs中lncRNA MEG3相對表達量降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；MTT檢測細胞增殖活性，結果顯示，與si-NC組比較，si-MEG3組PPDLSCs細胞在培養48 h和72 h時細胞增殖活性明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表5。

表5 抑制lncRNA MEG3對PPDLSCs細胞增殖的影響（±s）Tab.5 Inhibition of lncRNA MEG3 on proliferation of PPDLSCs （±s）

表5 抑制lncRNA MEG3對PPDLSCs細胞增殖的影響（±s）Tab.5 Inhibition of lncRNA MEG3 on proliferation of PPDLSCs （±s）

Note：1）P＜0.05 vs si-NC group.

2.4 抑制lncRNA MEG3逆轉柚皮苷對PPDLSCs成骨分化的促進作用 本研究構建抑制lncRNA MEG3表達的PPDLSCs。RT-qPCR結果顯示，與柚皮苷組+si-NC組比較，柚皮苷+si-MEG3組PPDLSCs中OCN、Runx2和ALP mRNA相對表達量均降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）；Western blot結果顯示，與柚皮苷組+si-NC組比較，柚皮苷+si-MEG3組PPDLSCs中OCN、Runx2和ALP蛋白相對表達量均降低（P＜0.05），差異具有統計學意義。見圖2、表6。

表6 各組PPDLSCs中成骨分化相關基因的表達（±s）Tab.6 Expression of genes related to osteogenic differentiation in PPDLSCs of each group （±s）

表6 各組PPDLSCs中成骨分化相關基因的表達（±s）Tab.6 Expression of genes related to osteogenic differentiation in PPDLSCs of each group （±s）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs naringin+si-NC group.

圖2 Western blot檢測OCN、Runx2和ALP蛋白表達Fig.2 Expressions of OCN， Runx2 and ALP were detected by Western blot

2.5 柚皮苷上調lncRNA MEG3對PPDLSCs中Wnt/β-catenin信號通路的影響 Western blot結果顯示，與對照組比較，柚皮苷組PPDLSCs中p-GSK3β、 β-catenin蛋白相對表達量均降低（P＜0.05），差異具有統計學意義；與柚皮苷組+si-NC組比較，柚皮苷+ si-MEG3組PPDLSCs中p-GSK3β、β-catenin蛋白相對表達量均升高（P＜0.05），差異具有統計學意義。見圖3、表7。

圖3 Western blot檢測Wnt/β-catenin通路蛋白表達Fig.3 Protein expression of Wnt/β-catenin pathway was detected by Western blot

表7 各組PPDLSCs中Wnt/β-catenin通路蛋白相對表達（±s）Tab.7 Relative expression of Wnt/β-catenin pathway protein in PPDLSCs of each group （±s）

表7 各組PPDLSCs中Wnt/β-catenin通路蛋白相對表達（±s）Tab.7 Relative expression of Wnt/β-catenin pathway protein in PPDLSCs of each group （±s）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs naringin+si-NC group.

3 討論

牙周炎是成年人口腔失牙的主要原因之一，近年來中醫藥治療通過調節機體內、外環境，促進牙周組織修復，在牙周疾病治療中受到廣泛關注［11-12］。hPDLSCs是一種來源于牙周膜組織的間充質干細胞，可分化形成骨組織、軟骨組織等，是牙周組織再生和修復最理想的種子細胞，然而由于缺氧、炎癥等微環境變化，均可損害PDLSCs的多重分化潛能［13］。

柚皮苷作為一種天然存在的黃酮類化合物，已被證實能夠促進牙周膜細胞活性、促進牙周韌帶細胞增殖和分化，促進骨髓間充質干細胞的成骨分化［14-16］。本研究分離培養PPDLSCs，使用不同濃度柚皮苷處理細胞，發現低濃度的柚皮苷能夠促進細胞增殖，而高濃度的柚皮苷則抑制細胞增殖，其中 1 μmol/L柚皮苷處理時細胞的增殖活性最佳。進一步對PPDLSCs進行成骨分化誘導，發現1 μmol/L柚皮苷處理能夠促進PPDLSCs中成骨相關基因的表達，說明柚皮苷能夠促進PPDLSCs的成骨分化能力。然而，柚皮苷通過哪些途徑促進PPDLSCs的成骨分化尚未探明。

lncRNA是一種非編碼RNA，沒有編碼蛋白質的能力，但可調控生理和病理過程中的關鍵調節因子，參與了包括癌癥、炎癥、心血管系統等疾病的發生和發展［17-18］。近來研究表明，lncRNA在牙周炎組織中表達失調可能參與了牙周炎的發病過程，如WANG等［19］報道lncRNA-POIR在牙周炎患者PPDLSCs中表達下調，功能研究發現lncRNA-POIR能夠正向調控PPDLSCs和HPDLSCs的成骨分化能力；HAN等［20］研究發現，lncRNA TUG1在牙周炎患者牙周韌帶組織和脂多糖誘導的hPDLCs中表達降低，干擾lncRNA TUG1可以調控炎癥條件下hPDLCs的增殖和分化；LIU等［21］研究發現，LncRNA MEG3在牙周炎組織中表達下調，過表達lncRNA MEG3能夠促進hPDLSCs的成骨分化。

本研究結果，與HPDLSCs比較，PPDLSCs中lnc-RNA MEG3表達下調，與LIU等［21］研究結果基本一致。此外，本研究在柚皮苷處理的PPDLSCs中發現，lncRNA MEG3的表達升高，提示柚皮苷對PPDLSCs成骨分化的促進作用可能與上調細胞中lncRNA MEG3的表達有關。本研究進一步在PPDLSCs中敲除lncRNA MEG3的表達進行回復實驗，發現敲除lncRNA MEG3后抑制了PPDLSCs細胞增殖，并減弱了柚皮苷對PPDLSCs成骨分化的促進作用。

Wnt/β-catenin信號通路是經典的Wnt信號通路，研究表明，Wnt/β-catenin信號通路激活是炎癥環境下hPDLSCs成骨分化抑制的重要原因之一［22-23］。本研究結果發現，與對照組比較，柚皮苷處理的PPDLSCs中p-GSK3β、β-catenin蛋白表達明顯降低，說明柚皮苷能夠抑制PPDLSCs中Wnt/β-catenin信號通路的活性，而敲減lncRNA MEG3后柚皮苷對Wnt/β-catenin信號通路活性的抑制作用減弱，說明柚皮苷可能通過上調lncRNA MEG3，進而抑制Wnt/ β-catenin信號通路活性，從而促進PPDLSCs的成骨分化。

綜上所述，本研究證實柚皮苷能夠促進PPDLSCs的成骨分化，并發現上調lncRNA MEG3表達，抑制Wnt/β-catenin信號通路可能是柚皮苷發揮作用的機制之一。