食管癌來源外泌體通過E2F4對CD4+T細胞向Th17細胞分化的影響①

樊 慧 陳林林 郭軍輝 李治國 王婭菲 柳 淼 王花花 趙乃闊 胡慶軍

（焦作市人民醫院消化一區，焦作 454000）

食管癌（esophageal cancer，EC）是全球第六大 癌癥死亡原因。2018年，估計新增EC確診病例57.2萬例，全球死亡病例50.9萬例［1］。近幾十年來，雖然根治性手術、化療和放療等綜合治療取得了很大進展，但是EC患者的預后仍然很差［2］。EC的發生和發展與多種因素有關，已有研究表明腫瘤免疫微環境與EC的發生發展密切相關［3］。輔助性T 細胞17（T helper cell 17， Th17）是CD4+T細胞來源的一種T細胞亞群，其在腫瘤免疫微環境中的比例增高與惡性腫瘤的發生發展有關。Th17細胞可產生IL-17，促進癌癥的發生發展［4］。此外，研究表明，EC患者Th細胞相關的免疫反應高度紊亂，其外周血中Th17細胞數量和IL-17含量顯著增加。Th17與腫瘤免疫和EC發病機制密切相關［5］。因此，阻斷CD4+T細胞向Th17細胞分化可能是一種新的治療EC方法。然而，EC中Th17細胞分化的機制仍很不明確。外泌體是來自不同細胞的膜泡，直徑40～100 nm。這些胞外體通過傳遞生物活性分子來促進與鄰近細胞的相互作用［6］。已有研究證明細胞間可通過外泌體進行轉錄因子的傳遞，從而達到細胞交流的目的［7］。此外有研究報道腫瘤來源外泌體可以促進腫瘤微環境中Th17細胞分化［8］。然而，腫瘤外泌體調控EC中Th17細胞分化的機制尚未完全確定。此外，研究表明，在腫瘤外泌體中E2F轉錄因子家族成員E2F4的轉錄水平明顯升高，該提示在腫瘤外泌體中E2F4可能在腫瘤微環境中發揮重要作用［9］。因此，本研究旨在探究EC中Th17細胞分化的機制及其機制是否與E2F4相關，以期為探究腫瘤免疫微環境與EC的發生發展關系及開發EC新的臨床治療靶點提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 收集于焦作市人民醫院體檢的健康患者的血液樣本。所有患者未曾接受過手術、放化療及其他免疫治療；無惡性腫瘤病史；無糖尿病史；無真菌感染性疾病；無過敏性疾病；無傳染性疾病。

1.1.2 試劑 人食管癌細胞Eca-109購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；人正常食管上皮細胞HEEC購自武漢普諾賽生命科技有限公司；sh-NC，sh-E2F4載體及其對應的慢病毒液和si-NC，si-E2F4均購自云舟生物科技（廣州）有限公司； MACS磁性細胞分選試劑盒購自德國Miltenyi biotec公司；TransExoTMCell Media Exosome Kit購自北京全式金生物技術有限公司；Lipo3000試劑盒，IL-17A Monoclonal antibody-PE（簡 稱IL-17-PE）和CD4 Monoclonal antibody-FITC（簡稱CD4-FITC）購自美國Thermo Fisher scientific公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司；E2F4、維甲酸相關核孤兒受體γt（retinoid-related orphan nuclear receptor γt，ROR-γt）和IL-17抗體購自英國Abcam公司；GAPDH抗體購自北京義翹神州科技股份有限公司；IL-17 ELISA檢測試劑盒購自R&D Systems公司

1.2 方法

1.2.1 外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的分離與培養 向血液中添加無菌PBS，以1∶1比例稀釋，充分混勻。取淋巴細胞分離液加入新的離心管內，吸取稀釋后的血液加入管內，淋巴細胞分離液與血液的比例為1∶2。 2 000 r/min離心20 min后，可見管內出現明顯分層，用巴氏吸管吸取白色單個核細胞層至新的離心管內。加入5倍量的Hank's液充分混勻，反復吹打。1 500 r/min離心10 min，重復該步驟3次。離心收集沉淀，含10%FBS的RPMI1640培養基重懸細胞，將PBMC置于37 ℃、5%CO2條件下培養。

1.2.2 免疫磁珠細胞分選法分選CD4+T細胞及純度鑒定 收集培養后的PBMC，加入MACS buffer重懸細胞，隨后加入CD4磁珠抗體，充分混勻。將細胞置于4 ℃條件下孵育20 min。離心收集細胞后，加入5 ml MACS buffer重懸細胞。分離柱安裝入磁場中，隨后將細胞懸液加至分離柱，自然流盡。再將MACS buffer加至分離柱，自然流盡，清洗分離柱2次。取下分離柱，加入MACS buffer沖下陽性細胞，重復2次。離心收集細胞，所得沉淀即為初始CD4+T細胞。使用PBS清洗CD4+T細胞3次，最后使用PBS重懸細胞沉淀并調整細胞密度至1×106個/ml，向細胞懸液中加入FITC標記的CD4熒光抗體，室溫條件下避光孵育30 min。離心收集細胞后，PBS清洗細胞2次后重懸細胞，立即上流式細胞儀檢測。

1.2.3 初始CD4+T細胞活化及處理 分離的初始CD4+T細胞在含有CD3/CD28的新鮮RPMI-1640培養液中過夜激活。將CD4+T細胞隨機分為PBS組、HEEC-Exo組、Eca-109-Exo組、sh-NC-Exo組、sh-E2F4-Exo組，按照分組，向細胞中添加PBS、HEECExo、Eca-109-Exo、sh-NC-Exo、sh-E2F4-Exo，其中外泌體量為20 μg/ml。CD4+T細胞用含有20 ng/ml IL-6、2.5 ng/ml轉化生長因子β1、2 μg/ml抗IL-4和2 μg/ml抗IFN-γ的新鮮RPMI1640培養液誘導Th17 細胞分化［10］。細胞繼續培養24 h后，收集CD4+T細胞，進行后續實驗操作。

1.2.4 細胞培養 HEEC和Eca-109細胞用含10% FBS的RPMI-1640培養基，置于37 ℃、5%CO2條件下靜置培養。待細胞密度達到80%～90%時，胰酶液消化細胞，按照1∶3比例進行傳代培養或根據實驗需求進行鋪板操作。

1.2.5 細胞轉染 將對數期生長的Eca-109細胞接種于6孔板，1×106個/孔。細胞繼續培養24 h后，將細胞隨機分為Eca-109組、sh-NC組（sh-NC慢病毒感染）、sh-E2F4組（sh-E2F4慢病毒感染）。采用 sh-NC慢病毒液和sh-E2F4慢病毒液（1×108TU/ml）感染Eca-109細胞。感染48 h后，更換含有嘌呤霉素（6 μg/ml）的培養基培養72 h，篩選陽性克隆。Eca-109組細胞不進行感染操作。隨后熒光顯微鏡觀察細胞發光情況，qRT-PCR和Western blot檢測細胞中E2F4表達。將活化后的CD4+T細胞接種于 12孔板，1×106個/孔。按Lipo3000說明書轉染si-NC和si-E2F4至CD4+T細胞，繼續培養48 h后，進行后續實驗。

1.2.6 外泌體的分離及鑒定 收集HEEC和Eca-109細胞培養上清液，4 ℃條件下300 r/min離心 30 min，去除上清液中殘留的細胞和碎片，向管內加入EPS-C溶液顛倒混勻后，4 ℃條件下靜置過夜。4 ℃、12 000 r/min離心30 min沉淀外泌體。收集沉淀，12 000 r/min離心5 min，棄去殘留上清。加入EPS-C溶液重懸沉淀，置于-80 ℃條件下保存。將HEEC和Eca-109細胞來源外泌體命名為HEECExo、Eca-109-Exo。將穩定表達sh-NC和sh-E2F4的Eca-109細胞來源的外泌體命名為sh-NC-Exo、sh-E2F4-Exo。

取HEEC-Exo、Eca-109-Exo、sh-NC-Exo、sh-E2F4-Exo置于銅網，3%磷鎢酸負染色液染色5 min，去除染色液。銅網晾干后，透射電鏡觀察外泌體形態。取適量HEEC-Exo、Eca-109-Exo、sh-NC-Exo、sh-E2F4-Exo，PBS稀釋，0.22 μm濾器過濾后，Nanosight納米粒度顆粒跟蹤分析儀進行外泌體粒徑檢測。Western blot實驗檢測外泌體標志性蛋白Alix、CD63和TSG101表達。

1.2.7 流式細胞術檢測CD4+T細胞向Th17細胞分化 取CD4+T細胞，預冷PBS重懸細胞并將細胞 密度調整為1×106個/ml。4%多聚甲醛固定細胞，加入CD4-FITC抗體（1∶100）室溫避光孵育30 min。0.2%TritonX-100通透15 min后，加入IL-17-PE抗體（1∶100），室溫避光孵育30 min。細胞經清洗后，立即上流式細胞儀檢測。

1.2.8 qRT-PCR檢測細胞中E2F4 mRNA表達 收集HEEC、Eca-109和CD4+T細胞，Trizol試劑提取細胞總RNA。將提取的RNA立即反轉錄為cDNA，該cDNA為qRT-PCR實驗的模板。按照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix說明書，進行qRT-PCR實驗。反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，共40個循環；95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算E2F4 mRNA表達。實驗所需引物序列見表1。

表1 qRT-PCR所需引物序列Tab.1 Sequence of primers required for qRT-PCR

1.2.9 ELISA檢測細胞上清液中IL-17的含量 收集CD4+T細胞培養上清液，根據IL-17 ELISA檢測試劑盒說明書所示，檢測各組細胞上清液中IL-17的含量。

1.2.10 食管癌異種移植小鼠模型的建立 21只 5周齡雄性BALB/c裸鼠在特定的無病原體條件下飼養。參考文獻［11］，建立食管癌異種移植小鼠模型。胰酶液消化穩定表達的sh-NC或sh-E2F4的Eca-109細胞以及正常的Eca-109細胞，無菌PBS重懸細胞制成單細胞懸液，調整細胞密度2.5×107個/ml。取0.2 ml細胞（5×106個）接種于裸鼠右側腋背部皮下。移植瘤每3 d用電子數顯游標卡尺檢查1次，腫瘤體積按以下公式計算：體積=（長×寬2）/2。16 d后處死小鼠，測量腫瘤體積。

1.2.11 Western blot檢測細胞中E2F4、ROR-γt和IL-17蛋白表達 收集HEEC、Eca-109和CD4+T細胞以及食管癌異種移植小鼠腫瘤，RIPA裂解液裂解細胞和組織，收集上清液，BCA法測定上清液的蛋白濃度。根據測定的濃度，吸取30 μg蛋白置于上樣孔內，進行SDS-PAGE凝膠電泳以及轉膜操作。5%脫脂奶粉室溫條件下封閉3 h，加入E2F4（1∶2 000）、ROR-γt（1∶1 000）、IL-17（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）抗體稀釋液，4 ℃條件下孵育過夜。加入特異性二抗稀釋液（1∶5 000），室溫條件下孵育1 h。滴加ECL發光液，凝膠成像系統檢測蛋白條帶，Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

1.3 統計學處理 使用SPSS21.0軟件分析統計數據。所有數據以±s表示。兩組間數據的比較采用t檢驗，多組數據間的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 外泌體的鑒定 透射電鏡觀察外泌體形態，結果如圖1A所示，HEEC-Exo和Eca-109-Exo均呈圓形囊泡結構；Western blot檢測外泌體標志性蛋白Alix、CD63和TSG101的表達，結果如圖1B所示，HEEC-Exo和Eca-109-Exo中Alix、CD63和TSG101蛋白呈陽性表達，而HEEC和Eca-109來源上清中Alix、CD63和TSG101蛋白表達不明顯；Nanosight納米粒度顆粒跟蹤分析儀進行外泌體粒徑檢測，結果如圖1C所示，HEEC-Exo和Eca-109-Exo直徑約為100 nm。

圖1 外泌體鑒定Fig.1 Identification of exosomes

2.2 CD4+T細胞的分選鑒定 采用免疫磁珠分選CD4+T細胞，流式細胞術檢測細胞純度，結果如圖2所示，CD4+T細胞比例為98.9%，細胞純度＞90%，可進行后續實驗。

圖2 流式細胞術檢測CD4+T細胞比例Fig.2 Flow cytometry was used to detect proportion of CD4+T cells

2.3 EC來源外泌體對CD4+T細胞向Th17細胞分化的影響 應用PBS、 HEEC-Exo或Eca-109-Exo處理CD4+T細胞，如圖3所示，與PBS組相比，HEECExo組CD4+T細胞中Th17細胞比例、ROR-γt蛋白表達和IL-17含量差異無統計學意義（P＞0.05）；與HEEC-Exo組相比，Eca-109-Exo組CD4+T細胞中Th17細胞比例、ROR-γt蛋白表達和IL-17含量明顯升高（P＜0.05）。

圖3 EC來源外泌體對CD4+T細胞向Th17細胞分化的影響Fig.3 Effect of exosomes derived from EC on differentiation of CD4+ T cells into Th17 cells

2.4 EC來源外泌體對CD4+T細胞中E2F4表達的影響 qRT-PCR和Western blot檢測HEEC和Eca-109細胞中E2F4表達，結果如圖4A、B所示，與HEEC組相比，Eca-109組細胞中E2F4 mRNA和蛋白表達均明顯升高（P＜0.05）。

應用PBS、HEEC-Exo、Eca-109-Exo處理CD4+T細胞，qRT-PCR和Western blot檢測CD4+T細胞中E2F4表達，結果如圖4C、D所示，與PBS組相比，HEEC-Exo組CD4+T細胞中E2F4 mRNA和蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）；與HEEC-Exo組相比，Eca-109-Exo組CD4+T細胞中E2F4 mRNA和蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。

圖4 EC來源外泌體對CD4+T細胞中E2F4表達的影響Fig.4 Effect of exosomes derived from EC on expression of E2F4 in CD4+T cells

2.5 sh-E2F4通過EC來源外泌體對CD4+T細胞中E2F4表達的影響 熒光顯微鏡觀察穩轉細胞系發光情況，結果如圖5A所示，sh-E2F4組和sh-NC組細胞發光率在90%以上。qRT-PCR和Western blot檢測Eca-109細胞中E2F4表達，結果如圖5B、C所示，與Eca-109組相比，sh-NC組細胞中E2F4 mRNA和蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）；與sh-NC組相比，sh-E2F4組細胞中E2F4 mRNA和蛋白表達均明顯降低（P＜0.05）。

圖5 sh-NC和sh-E2F4穩轉細胞系的構建Fig.5 Construction of stable transgenic sh-NC and sh-E2F4 cell lines

應用Eca-109-Exo、sh-NC-Exo、sh-E2F4-Exo處理CD4+T細胞，qRT-PCR和Western blot檢測CD4+T細胞中E2F4表達，結果如圖6A、B所示，與Eca-109-Exo組相比，sh-NC-Exo組細胞中E2F4 mRNA和蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）；與sh-NC-Exo組相比，sh-E2F4-Exo組細胞中E2F4 mRNA和蛋白表達均明顯降低（P＜0.05）。

圖6 sh-E2F4通過EC來源外泌體對CD4+T細胞中E2F4表達的影響Fig.6 Effect of sh-E2F4 on expression of E2F4 in CD4+T cells through exosomes derived from EC

2.6 sh-E2F4通過EC來源外泌體對CD4+T細胞向Th17細胞分化的影響 應用Eca-109-Exo 、sh-NCExo、sh-E2F4-Exo處理CD4+T細胞，結果如圖7所示，與Eca-109-Exo組相比，sh-NC-Exo組CD4+T細胞中Th17細胞比例、ROR-γt蛋白表達和IL-17含量差異無統計學意義（P＞0.05）；與sh-NC-Exo組相比，sh-E2F4-Exo組CD4+T細胞中Th17細胞比例、ROR-γt蛋白表達和IL-17含量均明顯降低（P＜0.05）。

圖7 sh-E2F4通過EC來源外泌體對CD4+T細胞向Th17細胞分化的影響Fig.7 Effect of sh-E2F4 on differentiation of CD4+T cells into Th17 cells through exosomes derived from EC

2.7 EC來源外泌體通過E2F4對CD4+T細胞向Th17細胞分化的影響 應用si-E2F4沉默CD4+T細胞中E2F4表達量，PBS和Eca-109-Exo處理CD4+T細胞。Western blot檢測CD4+T細胞中E2F4的表達，結果如圖8A，與si-NC PBS組相比，si-E2F4 PBS組CD4+T細胞中E2F4 蛋白表達明顯減低，差異有統計學意義（P＜0.01）；與si-NC Eca-109-Exo組相比，si-E2F4 Eca-109-Exo組CD4+T細胞中E2F4蛋白表達明顯降低（P＜0.01）。流式細胞術結果顯示（如圖8B），與si-NC PBS組相比，si-E2F4 PBS組CD4+T細胞中Th17細胞比例明顯減低，差異有統計學意義（P＜0.01）；與si-NC Eca-109-Exo組相比，si-E2F4 Eca-109-Exo組CD4+T細胞中Th17細胞比例明顯降低 （P＜0.001）。

圖8 EC來源外泌體通過E2F4對CD4+T細胞向Th17細胞分化的影響Fig.8 Effect of E2F4 on differentiation of CD4+T cells to Th17 cells by exosomes from EC

2.8 sh-E2F4抑制小鼠食管癌的生長和Th17細胞相關細胞因子的表達 將穩定表達sh-NC、sh-E2F4的Eca-109細胞接種于小鼠皮下，結果如圖9所示，與Eca-109組相比，sh-NC組小鼠腫瘤大小和E2F4、ROR-γt、IL-17蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）；與sh-NC組相比，sh-E2F4組小鼠腫瘤大小和E2F4、ROR-γt、IL-17蛋 白 表 達 均 明 顯 降 低（P＜0.05）。

圖9 sh-E2F4抑制小鼠EC的生長和Th17細胞相關細胞因子的表達Fig.9 sh-E2F4 inhibited growth of mouse EC and expression of Th17 cell-related cytokines

3 討論

腫瘤免疫微環境中Th17細胞數量的增加與EC的發生發展密切相關［12］。因此，有必要探討EC中Th17細胞分化的機制。在此，本研究證明了EC外泌體可促進CD4+T細胞向Th17細胞分化。進一步實驗結果證明，E2F4在EC外泌體誘導的Th17細胞分化中發揮重要作用。EC外泌體通過將E2F4傳遞至CD4+T細胞促進Th17細胞分化。

外泌體是細胞在生理和病理條件下釋放的雙層膜包裹的小囊泡，可通過不同的分子機制影響腫瘤免疫、腫瘤侵襲轉移、血管生成等［13-14］。研究表明，外泌體在腫瘤與微環境之間的信息交換中起重要作用［15］。腫瘤外泌體因在腫瘤微環境中的重要作用成為腫瘤研究的熱點。已有研究表明，腫瘤外泌體可以調節腫瘤中Th17細胞的分化。例如，胃癌細胞分泌的外切體可以在低糖條件下促進miR-451從癌細胞向浸潤性T細胞重新分布，從而促進Th17細胞分化［16］。鼻咽癌的相關研究表明，外泌體miR-24-3p通過抑制T細胞增殖和Th17細胞分化抑制鼻咽癌疾病進展［17］。本研究結果顯示，EC來源外泌體能上調CD4+T細胞中Th17細胞比例，上調Th17分化相關轉錄因子ROR-γt蛋白表達和IL-17含量。然而EC外泌體在Th17細胞分化中的潛在的機制尚未完全明確。

外泌體是膜包裹的納米囊泡，可以將不同的生物活性分子，如蛋白質、脂質和microRNAs，從供體細胞運送到受體細胞。因此，外泌體可以改變受體細胞的生理狀態［18］。研究表明，腫瘤原發部位分泌的外泌體可以被轉移的癌細胞或其他細胞內化，然后這些外泌體可以介導多種全身病理生理過程，促進生存、免疫抑制和轉移生態位發育［19］。研究表明，外泌體通過傳遞非編碼RNA調節轉移前微環境中的腫瘤浸潤性免疫細胞和基質成分，如CD4+T細胞、調節性T細胞和巨噬細胞等［20］。E2F轉錄因子家族成員在細胞周期、細胞分化、DNA修復和細胞死亡的調控中起著至關重要的作用［21］。先前的研究結果顯示，lncRNA LINC00337的過度表達可能通過招募E2F4上調爪蟾驅動蛋白樣蛋白2而增強食管鱗癌細胞自噬和對順鉑的耐藥性［22］。不難看出，E2F4在食管癌進展中發揮重要作用。此外，ZHENG 等［23］的研究結果顯示，E2F4是肝細胞癌預后不良的指標。此外，在肝細胞癌中，E2F4與包括B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞在內的免疫細胞浸潤呈正相關。本研究結果顯示，EC細胞中E2F4的表達明顯升高。EC來源外泌體可促進CD4+T細胞中E2F4的表達。敲低EC細胞中E2F4后發現，sh-E2F4-Exo可抑制CD4+T細胞中E2F4的表達。進一步實驗結果顯示，sh-E2F4-Exo可抑制CD4+T細胞中Th17細胞比例、ROR-γt蛋白表達和IL-17含量。該研究結果表明，EC來源外泌體通過E2F4促進CD4+T細胞向Th17細胞分化。

Th17型的免疫反應會引發長期的慢性炎癥，產生IL-17和其他促炎癥細胞因子，為腫瘤的發展創造有利的環境。這些細胞因子除了由腫瘤細胞產生外，還由免疫系統細胞產生，通過調節宿主免疫系統發揮功能，從而產生免疫抑制反應，而不是誘導有效的保護性免疫反應，從而促進腫瘤的生長和進展［24］。研究表明，Th17在宮頸癌的發生發展中發揮著重要作用。局部晚期宮頸癌患者外周血中Th17細胞數量明顯升高，而當患者接受同步放化療后Th17細胞數量則明顯降低。同步放化療后Th17細胞數量的減少與更好的治療效果、無進展生存時間和總生存期相關［25］。研究表明，阿托伐他汀通過抑制Th17細胞分化，抑制食管鱗狀細胞癌細胞的增殖［26］。主要由Th17細胞分泌的促炎癥細胞因子 IL-17A已被證實參與調控食管腺癌進展。IL-17A通過激活活性氧/核因子-κB途徑促進食管腺癌細胞遷移和侵襲。該結果提示，Th17細胞可能是食管腺癌的潛在治療靶點［27］。本研究結果顯示，敲低E2F4后，小鼠EC移植瘤中ROR-γt和IL-17蛋白表達均明顯降低，移植瘤大小明顯降低。該研究結果表明，EC來源外泌體可能通過E2F4促進CD4+T細胞向Th17細胞分化，從而促進腫瘤疾病進展。

綜上所述，本研究結果顯示EC來源外泌體介導的CD4+T細胞向Th17細胞分化的機制可能與誘導CD4+T細胞中E2F4表達有關。該研究結果為明確EC中Th17細胞分化的機制提供了新的研究基礎，同時也為EC的治療提供了新的潛在治療靶點。