貝伐珠單抗通過調控PI3K/AKT信號通路下調肺腺癌H1299細胞PD-L1表達①

張亞玲 劉 單 鄧述愷 （西南醫科大學附屬醫院呼吸內科，瀘州 646000）

肺癌是全球范圍內與癌癥相關的主要死亡原因，非小細胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC）約占所有肺癌的85%。程序性細胞死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）/程序性細胞死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）抑制劑通過阻斷抑制性受體與T細胞相互作用，恢復T細胞功能，增強機體免疫應答，在晚期NSCLC的治療中占據重要地位［1-2］。然而大多數患者對PD-1/PD-L1抑制劑的有效應答率低，迫切需要探尋包括聯合治療在內的更佳治療策略以提高療效。貝伐珠單抗（Bevacizumab，Beva）是一種人源化IgG1單克隆抗體，可特異性阻斷血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）與其受體（VEGFR）的結合，從而減少腫瘤新生血管形成［3］。近年來研究發現，抗VEGF治療可顯著降低腫瘤細胞PD-1、PD-L1及其他免疫檢查點阻斷分子的表達［4-5］。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路在NSCLC中過表達，與細胞增殖、血管生成及免疫調節等過程密切相關［6］。人肺腺癌H1299細胞株對VEGF有較強表達，而在產生VEGF的腫瘤中，抗VEGF治療與PD-1/PD-L1抑制劑具有協同作用［7］。為進一步探討抗血管生成藥物對免疫微環境的影響及其機制，本文通過設計實驗探討Beva對H1299細胞PD-L1、p-PI3K、p-AKT表達的影響，為臨床上肺癌的聯合治療提供有效方案及理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 H1299細胞株（西南醫科大學中心實驗室）；貝伐珠單抗（Roche Pharma Ltd公司）；740-YP、LY294002（MCE公司）；CCK-8檢測試劑盒（碧云天研究所）；1640培養基（HyClone公司）；CD274 Monoclonal Antibody、PE（eBioscience公司）；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、山羊抗兔二抗（南非Aspen公司）；兔抗人p-PI3K一抗、p-AKT一抗（美國CST公司）；內參GAPDH抗體（英國Abcam公司）；流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養及傳代 采用含10%胎牛血清的1640培養基培養肺腺癌H1299細胞，置于37℃、5%CO2培養箱中，貼壁生長至85%時用0.25%胰酶傳代。

1.2.2 CCK-8法檢測Beva對H1299細胞增殖抑制作用 向處于對數生長期的H1299細胞中分別加入5、10、20、40、80 μg/ml Beva，對照組加入等量培養液，設置5個復孔。分別培養36 h、48 h、72 h后，向每孔中加入10 μl CCK-8溶液孵育4 h，酶標儀測定450 nm吸光度值（OD值），計算不同時間Beva半數抑制濃度（IC50）及細胞增殖抑制率。選擇細胞增殖抑制作用最為明顯的72 h為后續實驗的干預時間，其對應的IC50為56.312 μg/ml，作為后續實驗的干預濃度。

1.2.3 流式細胞儀檢測Beva對H1299細胞PD-L1表達的影響 取對數生長期H1299細胞制備細胞懸液，接種于6孔板，加入1 ml 0.25%胰酶消化細胞，300 g離心5 min，棄上清，重懸，向H1299細胞中分別加入5、10、20、40、80 μg/ml Beva，對照組加入等量培養液，分別培養36 h、48 h、72 h，按照試劑盒說明步驟進行操作。實驗獨立重復3次。

1.2.4 流式細胞儀檢測各組細胞PD-L1表達 將對數生長期H1299細胞制成細胞懸液接種于6孔板，操作步驟同1.2.3。分為5組：①對照組：不加藥物處理；②Beva組：加入56.312 μg/ml Beva；③740-YP組：加入25 nmol/L 740-YP；④LY294002組：加入20 μmol/L LY294002；⑤Beva+740-YP組：加 入56.312 μg/ml Beva和25 nmol/L 740-YP；培養72 h，按照試劑盒說明步驟進行操作，使用流式細胞儀檢測各組細胞PD-L1表達情況，實驗獨立重復3次。

1.2.5 Western blot檢測各組細胞p-PI3K、p-AKT蛋白水平 將H1299細胞接種于6孔培養板，分為4組：①對照組：不加藥物處理；②Beva組：加入56.312 μg/ml Beva；③740-YP組：加入25 nmol/L 740-YP；④Beva+740-YP組：加入56.312 μg/ml Beva和25 nmol/L 740-YP；室溫孵育72 h后提取總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度，制膠、上樣、電泳、轉膜，5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，加入p-PI3K及p-AKT一抗4 ℃過夜，TBST漂洗，加二抗后再次漂洗，ELC發光劑顯影，定影，拍照，實驗獨立重復3次。

1.3 統計學方法 數據分析采用SPSS19.0統計軟件。計量資料以±s表示，各組之間數據采用單因素方差分析進行對比，組內比較用LSD-t檢驗，方差齊性檢測采用Levene法，檢驗水準α取0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Beva對H1299細胞增殖活性的影響 CCK-8法檢測結果顯示，在同一時間下，不同濃度Beva對H1299細胞增殖均有抑制作用，且抑制作用隨藥物濃度的增加逐漸增強（P＜0.05）。在36 h、48 h、72 h時，Beva的IC50分別為：87.435 μg/ml、69.049 μg/ml、56.312 μg/ml。見圖1、表1。

表1 各組H1299細胞增殖抑制率之間的比較（±s，n=5）Tab.1 Comparison of inhibition rate of H1299 cell proliferation in each group （±s，n=5）

表1 各組H1299細胞增殖抑制率之間的比較（±s，n=5）Tab.1 Comparison of inhibition rate of H1299 cell proliferation in each group （±s，n=5）

Note：Compared with 0 μg/ml Beva group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01.

圖1 CCK-8檢測貝伐珠單抗對H1299細胞增殖的影響Fig.1 Effect of Beva on proliferation of human lung denocarcinoma H1299 cells detected by CCK-8

2.2 Beva對H1299細胞PD-L1表達的影響 流式細胞術檢測結果顯示，在同一濃度不同時間點，Beva濃度≥20 μg/ml時，H1299細胞表面PD-L1表達量均能顯著降低（P＜0.05），且隨著時間延長，PD-L1表達量越低（P＜0.05）；在相同時間不同濃度下，H1299細胞表面PD-L1表達量隨Beva藥物濃度升高而下降（P＜0.05），但在36 h時，5 μg/ml Beva組分別與0 μg/ml Beva組、10 μg/ml Beva組相比，細胞PD-L1表達差異無統計學意義（P＞0.05），10 μg/ml Beva組與20 μg/ml Beva組相比，細胞PD-L1表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2、圖2。

圖2 不同濃度貝伐珠單抗作用H1299細胞不同時間對PDL1表達的影響Fig.2 Effect of different concentrations of Beva on H1299 cells and different time on PD-L1 expression

表2 不同濃度貝伐珠單抗作用H1299細胞不同時間對PD-L1表達的影響（±s，%）Tab.2 Effect of different concentrations of Beva on H1299 cells and different time on PD-L1 expression （±s，%）

表2 不同濃度貝伐珠單抗作用H1299細胞不同時間對PD-L1表達的影響（±s，%）Tab.2 Effect of different concentrations of Beva on H1299 cells and different time on PD-L1 expression （±s，%）

Note：Compared with 0 μg/ml Beva group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01.

2.3 Beva、740-YP、LY294002單藥使用和Beva聯合740-YP使用對H1299細胞PD-L1的影響 分別使用Beva、740-YP、LY294002單藥處理細胞和Beva聯合740-YP使用處理H1299細胞干預72 h，PD-L1表達量分別為：對照組（60.300±3.132）%、Beva組（20.633±4.130）%、740-YP組（81.000±3.120）%、LY294002組（19.167±2.483）%、Beva+740-YP組（72.600±2.862）%。與對照組相比，Beva組PD-L1表達量明顯降低，740-YP組PD-L1表達量明顯升高，LY294002組PD-L1表達量明顯降低（P＜0.01）；Beva+740-YP組PD-L1表達量較Beva組高、較740-YP組低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組H1299細胞PD-L1表達的情況Fig.3 PD-L1 expression of H1299 cells in each group

2.4 Western blot法檢測H1299細胞p-PI3K、p-AKT蛋白的表達 Beva/740-YP單藥處理或聯合處理H1299細胞干預72 h，p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平分別為：對照組（p-PI3K蛋白表達量0.313±0.031，p-AKT蛋白表達量0.122±0.028）、Beva組（p-PI3K蛋白表達量0.102±0.023，p-AKT蛋白表達量0.044±0.024）、740-YP組（p-PI3K蛋 白 表 達 量0.867±0.045，p-AKT蛋白表達量0.555±0.044）、Beva+740-YP組（p-PI3K蛋白表達量0.611±0.031，p-AKT蛋白表達量0.310±0.038）。與對照組相比，Beva組p-PI3K、p-AKT蛋白表達均較低（P＜0.05），而740-YP組p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平均較高（P＜0.05）；Beva+740-YP組p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平較Beva組高，較740-YP組低（P＜0.01，圖4）。

圖4 Western blot法檢測p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平Fig.4 Protein expression level of p-PI3K and p-AKT detected by Western blot

3 討論

PD-1/PD-L1抑制劑通過特異性阻斷CD8+T細胞的PD-1和腫瘤細胞表達的PD-L1的結合，重新激活T細胞進而有效殺傷腫瘤細胞［2］。Beva是新一代血管靶向抗腫瘤藥，通過抑制VEGF相關通路減少血管形成，抑制腫瘤的生長和轉移［3］。但單用PD-1/PD-L1抑制劑或單用抗血管生成藥物都不可避免地存在原發性或繼發性耐藥問題。文獻報道，Beva聯合PD-1/PD-L1抑制劑治療肺癌可協同抑制腫瘤生長［8］。然而，高劑量和/或長時間的抗血管生成藥物可能導致過度的“血管修剪”，反而加劇腫瘤組織缺氧，增強抑制性免疫微環境［9］。如何在聯合治療中優化抗血管生成治療方案以及抗血管生成藥物對免疫微環境的作用機制均值得進一步探討。

Beva對多種VEGF高表達的惡性腫瘤均具有明顯的抗癌活性［10］。HUANG等［9］研究表明，低劑量的抗血管生成劑優于較高劑量治療，可能是高劑量的抗血管生成藥物使腫瘤灌注迅速減少，周細胞覆蓋率降低，加劇腫瘤組織缺氧情況所致。WANG等的體外實驗表明，不同濃度Beva（0、1、5、25 μmol/L）處理A549細胞12 h、24 h、48 h、72 h，24 h后Beva以劑量依賴方式抑制癌細胞增殖［11］。本研究結果顯示，當不同濃度Beva處理H1299細胞36 h時，5 μg/ml、10 μg/ml Beva對細胞增殖抑制作用不明顯，48 h后以劑量依賴方式抑制H1299細胞增殖，與上述研究結果一致。

相關研究表明，VEGF-VEGFR信號參與腫瘤血管異常分化的同時也通過多種機制促進免疫抑制，主要包括誘導具有免疫抑制特性細胞（例如調節性T細胞、髓源性抑制細胞）的分化、阻礙樹突狀細胞成熟、上調免疫檢查點的表達來促進T細胞衰竭［4，12-13］。2015年，THIBAULT等［4］在大腸癌（CT26）小鼠模型中觀察到，靶向阻斷VEGF-VEGFR途徑能顯著降低腫瘤浸潤性CD8+T細胞上PD-1等抑制性免疫檢查點分子的表達。同樣，DENG等［5］也發現，抗VEGF類藥物能抑制人臍靜脈內皮細胞PD-L1的表達。抗VEGF治療能將腫瘤免疫環境從免疫抑制狀態轉變為免疫支持狀態，解除T細胞免疫抑制，其與抗PD-1/PD-L1療法具有協同作用，均可以有效阻斷PD-1/PD-L1軸。IMpower150試驗表明，與接受貝伐珠單抗+紫杉醇+卡鉑治療的患者相比，接受阿特珠單抗+貝伐珠單抗+紫杉醇+卡鉑治療的晚期非鱗NSCLC患者的生存率顯著提高［14］。此外，JVDF試驗和RIZVI等［15-16］進行的肺癌臨床試驗也表明兩藥聯合治療的療效明顯優于單一療法。為研究不同濃度Beva對肺癌免疫微環境的影響，本實驗選取5、10、20、40、80 μg/ml Beva作用于H1299細胞36 h、48 h、72 h，結果表明，在此范圍內，Beva以時間-劑量依賴方式下調肺癌細胞PD-L1的表達，并且在72 h，80 μg/ml Beva作用時下調作用最為顯著。

PI3K/AKT通路是細胞內具有酶活性的信號傳導途徑，通過磷酸化或去磷酸化下游效應分子改變通路活化狀態［17］。NSCLC中的多種因素可激活PI3K/AKT信號通路，例如上游EGFR、VEGFR及PI3K/AKT中的基因突變或擴增［18］。肺腺癌內皮細胞在VEGFR的刺激下，PI3K磷酸化產生第二信使三羧酸肌醇，促使下游效應子AKT磷酸化。PI3K通路被激活后，一方面促進了NSCLC細胞生長、增殖和新血管形成，另一方面誘導了PD-L1的表達從而介導腫瘤細胞免疫逃逸［17，19-20］。本實驗分別使用PI3K通路激活劑740-YP和PI3K抑制劑LY294002作用于H1299細胞時，發現PI3K通路激活后可顯著上調PD-L1的表達，而抑制PI3K通路表達可顯著下調PD-L1的表達，提示H1299細胞中PD-L1的表達受到PI3K/AKT通路的調控。此外，在單獨使用Beva干預H1299細胞時，Beva可顯著下調細胞表面PD-L1、p-PI3K、p-AKT蛋白表達，而加入740-YP后，Beva對PD-L1、p-PI3K、p-AKT蛋白抑制作用被解除，從而使上述蛋白表達增加。因此抗VEGF治療可能是在磷酸化水平上抑制H1299細胞PI3K/AKT通路的激活來下調腫瘤細胞PD-L1的表達，使得PD-1與PD-L1結合受阻，從而與PD-1/PD-L1抑制劑起到協同增效作用。

綜上所述，Beva在一定范圍內可以有效抑制人肺腺癌H1299細胞增殖，并通過抑制PI3K/AKT相關信號轉導下調人肺腺癌H1299細胞PD-L1的表達來改善免疫微環境，從而與PD-1/PD-L1抑制劑起到聯合抗腫瘤作用。