血漿環狀RNA hsa_circ_0034398在系統性紅斑狼瘡中的表達和意義①

黃自坤 高玉潔 羅 清 （南昌大學第一附屬醫院檢驗科，南昌 330006）

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus， SLE）是一種病因不明的，常見的慢性系統性自身免疫性疾病，好發于15～45歲女性［1］。血清中出現以抗雙鏈DNA抗體（anti-double-stranded DNA antibody，anti-dsDNA）、抗Sm抗體（anti-Smith antibody，anti-Sm）為代表的多種自身抗體和多組織、多器官受累是主要臨床特征。臨床研究證實，雖然目前出現新型的生物制劑和更有效的SLE治療策略，但其緩解率仍不高，造成這種狀況的原因之一是缺乏高度敏感性、特異性的SLE診斷方法、疾病進程監測以及治療評價的方法。環狀RNA（circular RNAs，circ-RNAs）是最近新發現的區別于傳統線性RNA的一類特殊RNA，主要由mRNA前體通過可變剪切加工產生，具有閉合環狀結構，大量存在于真核轉錄組中［2］。由于具有特殊的閉環結構，circRNA對核酸酶不敏感，因而具有良好的生物穩定性，且特定的circ-RNA具有疾病和組織特異性，這使得circRNA在作為新型臨床生物標志物的開發應用上具有明顯優勢［3］。已有大量的研究證實環狀RNA可用于多種疾病的診斷、療效判斷、監測復發等［4-6］。環狀RNA在SLE中的作用也逐漸被大眾認識［7-8］。LI等［8］采用circRNAs芯片分析發現SLE患者血漿circRNAs存在差異表達，且發現血漿hsa_circ_0034398在SLE患者中明顯上調，但并未評價其臨床意義以及診斷價值。本研究旨在檢測SLE患者、類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）患者和正常對照者（healthy controls，HC）血漿環狀RNA hsa_circ_0034398的表達水平，探討hsa_circ_0034398以及聯合血漿環狀RNA和常規SLE指標在SLE診斷和鑒別診斷中的作用。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 SLE疾病組來自于2019年4月至2020年7月在南昌大學第一附屬醫院風濕免疫科確診的42例初診未用藥的SLE患者，SLE的診斷依據美國風濕病學會（American College of Rheumatology，ACR）1997年修訂的分類標準［9］，并排除其他嚴重疾病。HC組來自同時期南昌大學第一附屬醫院進行體檢的健康人36例。SLE疾病組與HC組年齡、性別差異無統計學意義。RA疾病對照組來自于2019年4月至2020年7月在南昌大學第一附屬醫院風濕免疫科確診的42例初診未用藥RA患者，RA的診斷依據ACR 1987年修訂的RA診斷標準［10］，并排除其他嚴重疾病。各組患者的臨床特點，見表1。

表1 SLE患者、RA患者和HC的臨床特點（±s）Tab.1 Clinical characteristics of patients with SLE， RA and HC （±s）

表1 SLE患者、RA患者和HC的臨床特點（±s）Tab.1 Clinical characteristics of patients with SLE， RA and HC （±s）

Note：Compared with HC，1）P＜0.05； compared with SLE，2）P＜0.05.

1.1.2 主要試劑、儀器 MiRNeasy Mini Kit試劑盒購自德國Qiagen公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 和 SYBR?Premix Ex TaqTM購自 大連寶生物 TaKaRa公司；hsa_circ_0034398及內參基因GAPDH引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；Nanodrop ND-1000紫外分光光度計購自美國Nanodrop公司；Applied Biosystems 7500型熒光定量PCR儀器購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 血漿總RNA提取及cDNA合成 采集SLE組、RA組和HC組空腹乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝靜脈血2 ml，6 h內取300 μl血漿用900 μl MiRNeasy Mini Kit 試劑盒裂解液處理，置于-80 ℃冰箱保存。按MiRNeasy Mini Kit 試劑盒說明書的標準流程提取所有受試者血漿的總RNA，焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理過的蒸餾水溶解RNA。取1 μl提取的總RNA，按照說明書利用PrimeScript反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。

1.2.1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR） 采用TaKaRa實時熒光定量PCR SYBR Green 法，按照試劑盒說明書提供的檢測步驟、反應體系、反應條件進行。以GAPDH基因作為內參，采用ABI7500儀器進行環狀RNA水平的檢測，通過熔解曲線檢測環狀RNA PCR產物中有無非特異性擴增。根據待測標本的Ct值，采用相對定量法對RT-PCR結果進行分析，2-ΔΔCt計算［11］。ΔCt（疾病組）=Ct（疾病組目的環狀RNA）-Ct（疾病組GAPDH內參基因［6］），ΔCt（對照組）=Ct（對照組目的環狀RNA）-Ct（對照組GAPDH內參基因），ΔΔCt=ΔCt（疾病組）-ΔCt（對照組）。引物序列，見表2。

1.2.3 SLE治療 42例初診未治療的SLE患者，其中9例初診未治療者于治療前和治療半個月后收集其空腹EDTA抗凝外周血的血漿用于環狀RNA的檢測。初診未治療的SLE患者根據病情嚴重程度選取治療方案：①病情穩定（SLEDAI為0～4分）者維持治療；②病情輕度活動（SLEDAI為5～9分）者采用潑尼松或糖皮質激素+羥氯喹/甲氨蝶呤/來氟米特治療；③病情中度活動（SLEDAI為10～14分）者采用糖皮質激素+環磷酰胺/霉酚酸酯治療；④病情重度活動（SLEDAI≥15分）者先采用糖皮質激素沖擊加環磷酰胺，再按病情中度活動治療方案治療。

1.3 統計學分析 正態分布數據采用t檢驗，非正態分布數據采用非參數檢驗。治療前后的環狀RNA以及血沉的比較采用Pairedt檢驗或Wilcoxon matched pairs 檢驗。環狀RNA與SLE實驗室指標的關系采用Spearman相關分析。環狀RNA對于SLE診斷及鑒別診斷價值的評價采用受試者工作特征曲線（ROC）。數據分析均使用SPSS17.0軟件進行。以雙側P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 血漿環狀RNA hsa_circ_0034398在SLE患者和對照者中的表達水平 采用qRT-PCR檢測血漿環狀RNA hsa_circ_0034398在SLE疾病組和對照組中的表達水平表明：血漿環狀RNA hsa_circ_0034398在SLE組的表達水平明顯高于HC組（U=476.5，P=0.005 2，圖1A）和RA疾病對照組（U=591.0，P=0.009 4，圖1B），差異具有統計學意義。

圖1 SLE患者和對照組血漿環狀RNA hsa_circ_0034398表達水平Fig.1 Expression of plasma circular RNA hsa_circ_0034398 in SLE patients and controls

2.2 血漿環狀RNA hsa_circ_0034398表達與SLE患者實驗室指標的關系 SLE患者常用的實驗室指標在SLE患者和對照者中的差異見表1。分析實驗室指標與血漿環狀RNA hsa_circ_0034398表達水平的相關性發現，如圖2所示，SLE患者血漿環狀RNA hsa_circ_0034398表達水平與中性粒細胞百分比（neutrophil percentage，N%）呈正相關（rs=0.309 8，P=0.045 9），與單核細胞百分比（monocyte percentage，M%）（rs=-0.306 8，P=0.048 1）呈負相關。但未發現全血環狀RNA hsa_circ_0004156、hsa_circ_0082626表達水平與SLE患者的其他實驗室指標相關。

圖2 血漿環狀RNA hsa_circ_0034398表達與SLE患者 實驗室指標的關系Fig.2 Correlation of expression of plasma circular RNA hsa_circ_0034398 in SLE patients with laboratory index

表 2 RT-qPCR引物序列Tab.2 Sequences of RT-qPCR primers

2.3 血漿環狀RNA hsa_circ_0034398表達與治療的關系 分析治療與血漿環狀RNA hsa_circ_0034398的關系，在42例初診未治療的SLE患者中有9例于治療前和治療至少10 d后收集其血漿用于血漿環狀RNA hsa_circ_0034398的檢測，其中8例初診未治療SLE患者的血漿環狀RNA hsa_circ_0034398在治療后下降，1例初診未治療SLE患者的血漿環狀RNA hsa_circ_0034398在治療后升高。如圖3所示，SLE患者的血漿環狀RNA hsa_circ_0034398在治療后明顯下降（P=0.039 1）。且9例初診未治療的SLE患者的ESR在治療后明顯下降（P=0.010 1）。

圖3 血漿環狀RNA hsa_circ_0034398表達、ESR與SLE 患者治療的關系Fig.3 Correlation of expression of plasma circular RNA hsa_circ_0034398 and ESR in SLE patients with treatment

2.4 血漿環狀RNA hsa_circ_0034398對SLE的診斷價值 為了評估血漿環狀RNA hsa_circ_0034398對SLE診斷價值，繪制SLE疾病組區別于HC和RA疾病對照組的ROC曲線，結果如圖4所示，SLE疾病組血漿環狀RNA hsa_circ_0034398用于區別HC、RA疾病對照組和HC+RA對照組的AUC分別為0.685（圖4A）、0.665（圖4B）和0.674（圖4C）。以1.881為Cut-off，血漿環狀RNA hsa_circ_0034398診斷SLE疾病組與HC組的敏感度、特異度、準確度、陽性預測值、陰性預測值和約登指數分別為57.14%、77.78%、66.67%、75.00%、60.87%、0.349；以2.658為Cut-off，血漿環狀RNA hsa_circ_0034398鑒別SLE疾病組與RA疾病對照組的敏感度、特異度、準確度、陽性預測值、陰性預測值和約登指數分別為47.62%、95.24%、71.43%、90.91%、64.52%、0.429；以1.919為Cut-off，血漿環狀RNA hsa_circ_0034398鑒別SLE疾病組與HC+RA對照組的敏感度、特異度、準確度、陽性預測值、陰性預測值和約登指數分別為57.14%、82.05%、73.33%、63.16%、78.05%、0.392。

圖4 血漿環狀RNA hsa_circ_0034398的ROC曲線分析Fig.4 ROC curve analysis of plasma circular RNA hsa_circ_0034398

2.5 聯合血漿環狀RNA hsa_circ_0034398和常規指標對SLE的診斷價值 2.4結果表明血漿環狀RNA hsa_circ_0034398對SLE 診斷Cut-off 值為＞1.881（SLEvsHC）。根據ROC曲線獲得的Cut-off值和Anti-dsDNA、Anti-Sm是否為陽性來分析SLE患者和HC中血漿環狀RNA hsa_circ_0034398，Anti-ds-DNA，Anti-Sm，聯合hsa_circ_0034398+Anti-dsDNA，聯合hsa_circ_0034398+Anti-Sm，聯合hsa_circ_0034398+Anti-dsDNA+Anti-Sm對SLE的診斷敏感度、特異性、準確度、陽性預測值、陰性預測值和約登指數。如表3所示，聯合hsa_circ_0034398+AntidsDNA的敏感度（80.95%）均高于hsa_circ_0034398（57.14%）和Anti-dsDNA（57.14%），聯合hsa_circ_0034398+Anti-Sm的敏感度（69.05%）均高于hsa_ circ_0034398（57.14%）和Anti-Sm（26.13%）。且聯合hsa_circ_0034398+Anti-dsDNA+Anti-Sm（83.33%）的敏感度均高于hsa_circ_0034398+Anti-dsDNA（80.95%）和hsa_circ_0034398+Anti-Sm（69.05%）。

表3 Hsa_circ_0034398、Anti-dsDNA、Anti-Sm、聯合hsa_circ_0034398+自身抗體對SLE診斷價值的分析Tab.3 Analysis of hsa_circ_0034398， Anti-dsDNA， Anti-Sm， combination hsa_circ_0034398 and autoantibodies as SLE diagnosis

如表1所示，SLE患者、RA患者、HC三組間WBC、RBC、PLT存在明顯差異。聯合血漿環狀RNA hsa_circ_0034398、WBC、RBC和PLT對SLE診斷價值分析發現，SLE疾病組聯合血漿環狀RNA hsa_circ_0034398+WBC+RBC+PLT區別HC、RA疾病對照組和HC+RA對照組的AUC分別為0.864（圖5A）、0.906（圖5B）和0.878（圖5C），均高于單項血漿環狀RNA的AUC（0.685、0.665、0.674）（圖4）。聯合血漿環狀RNA hsa_circ_0034398+WBC+RBC+PLT診斷SLE疾病組與HC的敏感度和特異度分別為71.43%和91.67%；聯合血漿環狀RNA hsa_circ_0034398+WBC+RBC+PLT鑒別SLE疾病組與RA疾病對照組的敏感度和特異度分別為88.10%和88.10%；聯合血漿環狀RNA hsa_circ_0034398+WBC+RBC+PLT鑒別SLE疾病組與HC+RA對照組的敏感度和特異度分別為73.81%和92.31%。

圖5 聯合血漿環狀RNA hsa_circ_0034398+WBC+RBC+PLT的ROC曲線分析Fig.5 ROC curve analysis of combined plasma circular RNA hsa_circ_0034398+WBC+RBC+PLT

3 討論

circRNAs在血液中可長期穩定存在，RNA酶降解作用、煮沸、反復凍融、酸堿環境、長期保存等各種處理方法均不會造成血液circRNAs的損失，比較適宜作為基本的臨床診斷標志物［12］。近期，國內外學者嘗試探討血漿circRNAs作為SLE診斷標志物的可行性，如OUYANG等［13］發現血漿circRNA_002453在狼瘡腎中明顯上調，并且其含量與24 h蛋白尿和SLE腎損的活動性評分呈正相關，進一步ROC曲線分析發現circRNA_002453的AUC可達到0.906，這表明血漿circRNAs可作為SLE的潛在新型分子標志物。LI等［8］等采用circRNAs芯片分析發現SLE患者血漿circRNAs存在差異表達，且發現血漿hsa_circ_0034398在SLE患者中明顯上調，但并未評價其診斷價值。本文進一步驗證血漿hsa_circ_0034398的表達水平，發現其在SLE患者血漿中的表達水平明顯高于HC。此外，本研究還檢測RA對照組中血漿hsa_circ_0034398的含量，發現SLE患者的血漿hsa_circ_0034398的表達水平明顯高于RA患者。

之前的研究表明血漿circRNAs可作為SLE的疾病活動性和疾病嚴重程度的評估指標［13］。本研究分析了血漿hsa_circ_0034398與SLE患者的SLEDAI、自身抗體、ESR、C3、C4、治療等臨床與實驗室指標的關系，發現血漿hsa_circ_0034398與SLE患者的M%呈負相關、與N%呈正相關。可通過增加自身凋亡從而介導自身抗體的產生而參與SLE的致病，升高的SLE患者血漿hsa_circ_0034398與M%呈負相關，表明其可能通過影響M的凋亡而影響M%而參與SLE的致病［14］。SLE作為一種系統性的慢性炎癥反應，N%可作為其炎癥程度的指標，其在SLE患者的含量也顯著升高。并且SLE患者血漿hsa_circ_0034398與N%呈正相關，表明其可能與SLE患者的炎癥有關。此外，SLE患者的血漿hsa_circ_0034398在治療后可明顯下降。與其他血漿circRNAs研究相似，本研究結果證實了SLE患者血漿hsa_circ_0034398與SLE患者的炎癥程度以及治療相關，其可能作為評估SLE疾病嚴重程度和活動度的指標［7，13］。

本文采用ROC曲線分析血漿環狀RNA hsa_circ_0034398的診斷價值發現，血漿環狀RNA hsa_circ_0034398可有效的從HC和疾病對照者中診斷出SLE，這與其他研究相似［7，13］。在此基礎上考慮到，Anti-dsDNA和Anti-Sm是公認的SLE診斷指標，但其診斷敏感度較低，約為40%～50%和10%～30%［15-16］。且有研究顯示Anti-dsDNA等自身抗體聯合其他SLE診斷指標可明顯提高其診斷敏感度和特異度［15］。因此，本研究比較血漿環狀RNA hsa_circ_0034398，Anti-dsDNA，Anti-Sm，聯合血漿環狀RNA hsa_circ_0034398+Anti-dsDNA，聯合血漿環狀RNA hsa_circ_0034398+Anti-Sm，聯合血漿環狀RNA hsa_circ_0034398+Anti-dsDNA+Anti-Sm的診斷效能顯示，聯合血漿環狀RNA hsa_circ_0034398+自身抗體對SLE的診斷敏感度均高于血漿環狀RNA hsa_circ_0034398，Anti-dsDNA，Anti-Sm。此外，SLE患者可涉及血液系統的損傷，本文的研究也證實了血液系統損傷指標WBC、RBC、PLT在SLE患者、RA患者、HC對照組中存在差異。也有研究表明可采用PLT相關參數等血常規指標用于疾病診斷價值的研究［17］。鑒于此，本研究還分析聯合血漿環狀RNA hsa_circ_0034398+WBC+RBC+PLT在SLE中的診斷效能，結果顯示聯合血漿環狀RNA hsa_circ_0034398+WBC+RBC+PLT在區別SLE疾病組與HC、RA疾病對照組、HC+RA對照組的AUC分別為0.864、0.906、0.878；敏 感 度 分 別 為71.43%、88.10%、73.81%；特異度分別為91.67%、88.10%、92.31%。由此可以看出聯合血漿環狀RNA hsa_circ_0034398+WBC+RBC+PLT對SLE的診斷效能明顯升高。結果表明，血漿環狀RNA hsa_circ_0034398可能作為SLE診斷及鑒別診斷指標，尤其是聯合血漿環狀RNA hsa_circ_0034398和自身抗體、血液系統損傷指標。

本文存在以下不足：SLE患者病例數不夠多，尤其是治療前后收集到血漿樣本的SLE患者。雖然采用合適的統計學方法得出治療與血漿環狀RNA hsa_circ_0034398相關，但后續應該加大SLE患者病例數，尤其是治療前后的SLE患者，進一步證實SLE患者血漿環狀hsa_circ_0034398表達水平與治療的關系。

綜上，SLE患者血漿環狀RNA hsa_circ_0034398明顯升高，且與疾病炎癥程度以及治療相關，可能作為SLE的潛在診斷及鑒別診斷標志物，尤其是聯合血漿環狀RNA hsa_circ_0034398+SLE常用指標的診斷效能明顯升高。但hsa_circ_0034398如何調控SLE發病還不清楚，希望通過更多的研究來探討hsa_circ_0034398在SLE中所呈現的致病作用。