過表達SIRT1通過上調幽門螺桿菌感染的胃癌細胞自噬通量以促進其凋亡并抑制炎癥因子釋放①

郭偉勝 付利然 張 娟 趙 林 魏光亞 （河南省中醫院普外科，鄭州 450000）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori， Hp）是最常見的人類病原體之一，其感染人數可達世界總人口的1/2，且能夠在無抗生素干預的條件下長期持續存在［1］。Hp感染通?？梢鹇匝装Y和細胞損傷，并通過慢性胃炎、腸上皮化生，非典型增生等Correa級聯反應，最終導致胃癌發生［2-3］。既往研究認為，Hp是一種胞外定植的細菌，但越來越多的證據表明Hp具有兼性胞內性質，即細菌能夠在胃上皮細胞內存活甚至繁殖［4-5］。而Hp的上述生存方式不僅能使其逃避先天性免疫反應，還能對相關根除治療產生更強的耐藥性［6］。但迄今為止，Hp誘導胞內定植及生存繁殖的相關機制卻知之甚少。

自噬是一個進化保守的過程，可分為兩個步驟。首先，雙膜自噬體形成并隔離細胞內成分；其次，自噬-溶酶體合并最終降解自噬體內容物，后一步也被稱為自噬通量［7-8］。自噬可被多種有害刺激誘導產生，并在防止病原體感染和維持機體穩態等方面發揮重要作用。近期有研究報道，在自噬通量發生前，Hp可誘導自噬體形成，并能在其中進行繁殖，但當自噬通量發生時，細胞能以溶酶體依賴的方式清除Hp，即Hp可能通過抑制細胞中自噬通量增加胞內細菌的存活和定植，但其拮抗自噬通量的具體機制仍有待闡明［9-10］。

沉默信息調節因子1（silence information regulator 1，SIRT1）屬于Ⅲ類組蛋白去乙?；?，其能夠通過一系列轉錄因子的去乙酰化介導自噬，從而對細胞的增殖、代謝與凋亡等過程產生重要作用［11］。同時，有數據表明SIRT1可通過上調細胞中自噬通量促進自噬發生［12］。在胃癌中，SIRT1被認為是胃癌良好的預后因子，其在腫瘤組織中的表達與腫瘤分期、淋巴浸潤呈負相關，而與生存率提高呈正相關［13］。但在Hp感染的胃癌細胞中，SIRT1是否參與Hp介導的自噬通量抑制及其相關作用尚無報道，因此本研究通過體內外實驗探究SIRT1在Hp感染的胃癌細胞中的作用及其相關機制，以期為治療Hp誘導的胃癌提供新的策略及可能的研究靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本來源 收集自2018年1月至2020年10月于河南省中醫院就診并行部分或全部胃切除術的68例胃癌患者（男性45例，女性23例，中位年齡56歲，年齡27～79歲），其中通過活檢或術后病理確認共有37例Hp陰性患者，設為GC（Hp-）組，31例Hp陽性患者，設為GC（Hp+）組，同時從37例Hp-陰性患者的胃癌手術切除的腫瘤標本中，選取32例癌旁（≥3 cm）正常胃黏膜組織樣本設為正常對照（Normal）組。受試者納入標準：均為原發性胃癌，無合并其他器官或系統的惡性腫瘤，且既往無放療或化療史。本研究通過河南省中醫院醫學倫理委員會審批，所有受試者或其親屬均簽署知情同意告知書。

1.1.2 菌株、細胞系與主要試劑 Hp 26695標準菌株（CagA+/VacA-）購自中國疾病控制中心；胃癌細胞系AGS、MNK45、HGC27和SGC-7901均購自美國ATCC；RPMI1640培養液、0.25%含EDTA的胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；胎牛血清（FBS）、Opti-MEM（美國Gibco公司）；兔抗SIRT1、Bcl-2單克隆抗體、兔抗LCB、SQSTM1/p62多克隆抗體（美國Abcam公司）；兔抗Bad、cleaved caspase-9與cleaved-caspase-3單克隆抗體（美國CST公司）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗、Annexin V-FITC/PI試劑盒（江蘇碧云天生物科技有限公司）；DAB染色試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；逆轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT、SYBR Green定量聚合鏈式反應的RT-PCR試劑盒、PrimeScript RT Master Mix（日本Ta-KaRa公司）；攜帶過表達SIRT1及陰性對照序列質粒的慢病載體（LV-SIRT1與LV-NC）由廣州銳博生物有限公司合成及鑒定；mRFP-EGFP-LC3B質粒（上海欽誠生物科技有限公司）；TRIzol（美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色（immunohistochemistry，IHC） 將1.1中收集的組織樣本置于4%福爾馬林中固定24 h，常規石蠟包埋并切片至4 μm，二甲苯透明，梯度乙醇脫蠟至水后，置于10 mmol/L（pH=6.0）檸檬酸緩沖液中微波抗原提取20 min，隨后3%過氧化氫溶液常溫孵育10 min以阻斷內源性過氧化氫酶，山羊血清進行抗體封閉后，加入稀釋后的SIRT1抗體（1∶800）于4 ℃下孵育過夜，PBS充分洗滌后，添加辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000）并于室溫下孵育2 h，DAB試劑染色20 min，最后蘇木精復染細胞核。使用雙盲法，分別由兩位高年資病理科醫師根據文獻［14］方法評估染色強度與特定染色強度細胞的百分比判定樣本結果。

1.2.2 細胞培養與慢病毒感染 使用含10%FBS與1%青鏈霉素的RPMI1640完全培養基培養胃癌細 胞 系AGS、MNK45、HGC27和SGC-7901，置 于37 ℃、含5%CO2的恒溫培養箱中培養。取生長狀態良好的AGS細胞，調整細胞密度至3×105個/ml接種至6孔板，培養過夜后，更換培養基為opti-MEM溶液，使用過表達SIRT1及陰性序列的慢病毒載體LV-SIRT與LV-NC感染AGS細胞48 h后，以8 μg/ml嘌呤霉素處理感染后的細胞進行篩選以建立穩定感染細胞系，RT-PCR檢測感染效率。

1.2.3 RT-PCR實驗 收集慢病毒感染后的AGS細胞，TRIzol法提取細胞中總RNA，分光光度計測定其濃度后，使用試劑盒進行逆轉錄。按照SYBR Green定量聚合鏈反應試劑盒說明書方法進行 RT-PCR。SIRT1（F）：5＇-AACCTCCTGTTGACCGATG-3＇，SIRT1（R）：5＇-CCGTCTCTTGATCTGAAGTCA-3＇；CagA（F）：5＇-ATAATGCTAAATTACACAACT-3＇，CagA（R）：5＇-TTAGAATAATCAACAACATC-3＇；β-actin（F）：5＇-CCTGGCACCCAGCACAAT-3＇，β-actin（R）：5＇-GGGCCGGACTCGTCATAC-3＇。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt方法分析SIRT1表達量。上述實驗單獨重復3次。

1.2.4 Hp的感染及細胞分組 在37 ℃微氧環境（5%O2、10%CO2、85%N2）下使用含10%羊血清的彎曲弧菌瓊脂培養板進行Hp培養。取上述慢病毒感染后的AGS細胞，調整細胞密度至2×105個/孔接種至6孔板中培養48 h，待細胞生長融合至80%左右時，去除原培養液，更換為含0.5%FBS的新鮮培養基。收集Hp菌落，使用布魯氏菌肉湯制成細菌懸液，分光光度計在660 nm波長處測定細菌密度，參考文獻［15］按感染復數（MOI）=100加入AGS及轉染后的AGS細胞，并將其分為4組：LV-NC組、LVSIRT1組、Hp感染的LV-NC組（Hp+LV-NC）和Hp感染的LV-SIRT1組（Hp+LV-SIRT1），置于37 ℃微氧環境中培養48 h后進行相關實驗。

1.2.5 mRFP-EGFP-LC3B熒光顯微鏡觀察 取慢病毒感染后胃癌細胞按5×104個/孔接種至蓋玻片，培養過夜后，按Lipofectaimin3000轉染試劑說明書將100 nmol/L的mRFP-EGFP-LC3B質粒轉染入各組胃癌細胞中，按1.2.4方法進行Hp感染后，使用4%多聚甲醛進行固定，熒光顯微鏡隨機每組取5個視野進行觀察拍照。串聯mRFP-EGFP-LC3B熒光蛋白質粒發出mRFP的紅色斑點熒光時表示自噬體與溶酶體結合形成自噬溶酶體，提示自噬流通暢；而發出mRFP的紅色熒光與EGFP綠色熒光Merge后的黃色或橙黃色斑點熒光時，表示未與溶酶體結合的自噬體，提示自噬流受阻。即根據紅、黃熒光斑點可顯示細胞中自噬流情況。

1.2.6 ELISA 取1.2.4中的各組胃癌細胞，取細胞上清液，室溫下2 200 r/min離心10 min后，根據ELISA試劑盒說明書方法檢測各組胃癌細胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8表達水平。實驗單獨重復3次。

1.2.7 Annexin V-FITC/PI檢測細胞凋亡 使用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒檢測各組胃癌細胞凋亡率。簡述如下：收集各組胃癌細胞，調節細胞密度，取約2×105個細胞至流式管中，200 μl結合緩沖液重懸細胞后，加入10 μl Annexin V-FITC與5 μl PI溶液，室溫下避光孵育15 min，最后加入300 μl結合緩沖液，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。實驗單獨重復3次。

1.2.8 Western blot實驗 樣本組織或細胞在含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中裂解，BCA法檢測蛋白濃度，加熱變性后，取約25 μg蛋白樣品進行SDSPAGE凝膠分離，轉移至PVDF膜后，5%脫脂奶粉于室溫下孵育1 h進行抗體封閉，加入適當稀釋后的一 抗：SIRT1（1∶500）、CagA（1∶1 000）、LC3B（1∶ 1 000）、p62（1∶1 000）、Bcl-2（1∶800）、Bad（1∶800）、cleaved caspase-3（1∶1 000）、cleaved caspase-3（1∶ 1 000）、β-actin（1∶1 500） 4 ℃孵育過夜，加入稀釋后的二抗（1∶5 000）于室溫下孵育1 h，滴加ECL發光液，在Bio-Rad凝膠成像系統中拍照，以β-actin為內參，使用Image J軟件進行半定量分析。其中CagA蛋白被認為是Hp誘導胃癌產生的主要原因，且我國大部分胃癌患者均為CagA+的Hp菌株［16-18］，因此使用Western blot檢測胃癌樣本中CagA蛋白表達對感染Hp的組織進行鑒定與校對。實驗單獨重復 3次。

1.3 統計學分析 實驗數據以±s表示。采用GraphPad Prism 5.0軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），采用LSD-t進行多重比較。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 SIRT1在胃癌組織中的表達 IHC結果顯示，與Normal組相比，SIRT1在Hp+胃癌組織中表達強度明顯降低（P＜0.05），在Hp-胃癌組稍有降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與Hp-胃癌組相比，SIRT1在Hp+胃癌組織中的表達強度顯著降低（P＜0.05，圖1A）；Western blot結果表明，SIRT1在Hp+胃癌組織中蛋白表達水平較Normal組和Hp-胃癌組織顯著降低（P＜0.05）；Hp+胃癌組織中CagA表達水平較Normal組和Hp-胃癌組明顯提高（P＜0.01），且后兩組樣本中SIRT1與CagA差異均無統計學意義（P＞0.05，圖1B）。

圖1 SIRT1在Hp+胃癌組織中表達異常降低Fig.1 Abnormal decreased expression of SIRT1 in Hp+ gastric cancer tissues

2.2 Hp感染對胃癌細胞中SIRT1表達的影響 Western blot檢測結果顯示，SIRT1在胃癌細胞系AGS中表達顯著高于MNK45、HGC27和SGC-7901細胞（P＜0.05，圖2A）；RT-PCR檢測結果顯示AGS細胞中CagA mRNA表達水平隨Hp刺激時間延長而升高（P＜0.05），48 h呈穩定表達狀態（圖2B）；同時，AGS細胞中SIRT1蛋白表達水平逐漸降低，與0 h相比，Hp刺激12 h后上述細胞中SIRT1蛋白表達均明顯降低（P＜0.05），且以48 h的降低幅度最為顯著 （P＜0.01，圖2C），提示Hp感染可時間依賴性地降低胃癌細胞中SIRT1表達。因此，后續選擇Hp感染48 h后的AGS進行實驗（圖2B）。

圖2 Hp感染降低胃癌細胞中SIRT1表達Fig.2 Hp infection reduces SIRT1 expression in gastric cancer cells

2.3 過表達SIRT1的慢病毒載體感染后對胃癌細胞中SIRT1表達的影響 RT-PCR結果顯示，與感染LC-NC組相比，LV-SIRT1組中SIRT1 mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05，圖3A）；Western blot檢測結果顯示，與LV-NC組相比，LV-SIRT1組中SIRT1蛋白水平明顯升高（P＜0.05），Hp+LV-NC組與Hp+LVSIRT1組中SIRT1表達顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），但與Hp+LV-NC組相比，Hp+LV-SIRT1組明顯升高（P＜0.05，圖3B）。

圖3 慢病毒感染提高胃癌細胞中SIRT1表達Fig.3 Lentivirus infection increases SIRT1 expression in gastric cancer cells

2.4 過表達SIRT1對胃癌細胞自噬水平的影響 Western blot檢測結果顯示，與LV-NC組相比，LVSIRT1組、Hp+LV-NC組和Hp+LV-SIRT1組中自噬標記物LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均明顯增加（P＜0.05），LVSIRT1組中SQSTM1/p62蛋白水平明顯降低（P＜0.05），但Hp+LV-NC組 和Hp+LV-SIRT1組 中SQSTM1/p62蛋白水平均明顯增加（P＜0.05）；與Hp+LV-NC組相比，Hp+LV-SIRT1組中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ無明顯變化（P＞0.05），SQSTM1/p62蛋白明顯降低（P＜0.05，圖4A）。熒光顯微鏡觀察結果表明，與LV-NC組相比，LV-SIRT1組中出現大量紅色熒光斑點，而Hp+LV-NC組和Hp+LV-SIRT1組中呈黃色熒光斑點，即Hp感染促進了胃癌細胞中自噬通量的抑制；而與Hp+LV-NC組相比，Hp+LV-SIRT1組中紅色熒光斑點明顯增多，提示過表達SIRT1能改善Hp對胃癌細胞中自噬通量的抑制作用（圖4B）。

圖4 過表達SIRT1改善Hp對胃癌細胞中自噬流的抑制 作用Fig.4 Overexpression of SIRT1 improves inhibitory effect of Hp on autophagy flow in gastric cancer cells

2.5 過表達SIRT1對Hp感染的胃癌細胞表達炎癥因子的影響 ELISA結果顯示，與LV-NC組相比，LV-SIRT1組上清液中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），但Hp+LVNC組和Hp+LV-SIRT1組中上述炎癥因子均顯著增加（P＜0.05）；與Hp+LV-NC組相比，Hp+LV-SIRT1組中TNF-α、IL-1β和IL-8表達水平均明顯降低（P＜0.05），見表1。

表1 ELISA檢測各組胃癌細胞上清液中TNF-α、IL-1β 和IL-8表達水平（±s，pg/ml）Tab.1 Expression levels of TNF-α， IL-1β and IL-8 in supernatant of gastric cancer cells in each group were detected by ELISA （±s，pg/ml）

表1 ELISA檢測各組胃癌細胞上清液中TNF-α、IL-1β 和IL-8表達水平（±s，pg/ml）Tab.1 Expression levels of TNF-α， IL-1β and IL-8 in supernatant of gastric cancer cells in each group were detected by ELISA （±s，pg/ml）

Note：Compared with LV-NC group， 1）P＜0.05； compared with Hp+LVNC group， 2）P＜0.05.

2.6 過表達SIRT1對Hp感染胃癌細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測結果顯示，與LV-NC組相比，LV-SIRT1組與Hp+LV-SIRT1組胃癌細胞凋亡率明顯增加（P＜0.05），而Hp+LV-NC組凋亡率無明顯變化（P＞0.05）；與Hp+LV-NC組相比，Hp+LV-SIRT1組細胞凋亡率明顯增加（P＜0.05，圖5）。

圖5 過表達SIRT1上調Hp感染胃癌細胞凋亡率Fig.5 Overexpression of SIRT1 up-regulates apoptosis rate of Hp infected gastric cancer cells

2.7 過表達SIRT1對Hp感染胃癌細胞中凋亡相關蛋白表達的影響 Western blot檢測各組胃癌細胞中凋亡相關蛋白Bcl-2、Bad及cleaved caspase-9與cleaved-caspase-3的表達結果顯示，與LV-NC相比，LV-SIRT1組與Hp+LV-SIRT1組中抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯降低（P＜0.05），而促凋亡相關蛋白Bad及cleaved caspase-9與cleaved-caspase-3表達顯著升高（P＜0.05），Hp+LV-NC組上述蛋白指標差異無統計學意義（P＜0.05）。與Hp+LV-NC組相比，Hp+LVSIRT1組Bcl-2明顯降低（P＜0.05），而Bad及cleaved caspase-9與cleaved-caspase-3明顯升高（P＜0.05， 圖6）。

圖6 Western blot檢測各組胃癌細胞中凋亡相關蛋白表達Fig.6 Expressions of apoptosis-related proteins in gastric cancer cells of each group was detected by Western blot

3 討論

Hp是胃癌發展中公認的確定因素之一，流行病學資料顯示，約90%的胃癌可歸因于Hp感染，而根除Hp可將胃癌的發病率降至原來的1/3以下［19-21］。自噬作為進化中的保守過程，不僅可作為一種防御機制被激活以消除病原體感染，還能在癌癥中誘導細胞自噬性死亡以維持機體穩態［22-23］。研究表明，Hp在急性感染期間可通過分泌多種毒力因子來干擾胃黏膜上皮細胞的正常結構與功能，而此時自噬作為一種重要的防御機制，可通過溶酶體等途徑誘導細胞凋亡以限制Hp的生存與繁殖。但發生慢性感染時，Hp可通過誘導自噬相關蛋白的功能發生障礙，使細胞中自噬水平出現抑制，以維持其持續感染［24］。然而，Hp在其中的作用及相關機制仍不清楚。本研究結果表明，Hp感染可抑制胃癌細胞中SIRT1表達水平，但在利用慢病毒過表達細胞中SIRT1可通過削弱Hp對腫瘤細胞中自噬通量的抑制作用上調細胞自噬水平，并促進胃癌細胞凋亡。

SIRT1是一類煙堿氨酰嘌呤二核苷酸依賴的去乙?；福淇赏ㄟ^乙?；M蛋白和許多非組蛋白靶點參與影響腫瘤的發展、能量穩態、自噬、DNA損傷與修復及炎癥等病理生理過程。同時，SIRT1的表達水平也是包括胃癌在內的多種腫瘤的預后指標。有研究報道，SIRT1在裸鼠移植瘤模型的體內外均能抑制胃癌細胞生長，且過表達后可通過下調NF-κB信號通路活性抑制細胞增殖和腫瘤發展［25］。此外，白藜蘆醇能以SIRT1依賴的方式在荷瘤小鼠體內外抑制胃癌的進程，研究也表明SIRT1在胃癌發展中的抑癌作用［26］。然而，在其他研究中則報道了SIRT1在胃癌中的促進作用。如，CHA等［27］利用組織芯片和IHC對177例胃癌患者的組織樣本進行檢測發現，73%（130/177）的胃癌患者出現SIRT1陽性表達，同時FENG等［28］研究表明，胃癌組織中高表達的SIRT1與患者腫瘤分期、淋巴結轉移和腫瘤的侵襲程度呈正相關。LI等［29］則利用動物模型發現胃癌肥胖小鼠中SIRT1表達水平顯著高于瘦小鼠，且上調促生存Nampt/SIRT1/c-myc正反饋環表達可增強小鼠前胃癌細胞的遷移、增殖和細胞周期進程，同時降低細胞凋亡。因此，SIRT1在胃癌發展中的矛盾作用仍有待進一步探究。本實驗通過IHC及Western blot檢測發現SIRT1在Hp陽性胃癌組織樣本中的表達顯著低于癌旁正常組織與Hp陰性胃癌組織，且體外研究表明，隨Hp刺激時間延長，胃癌細胞中SIRT1表達明顯降低，提示Hp感染可能是影響SIRT1在胃癌中表達的作用因素之一。

同時，作為一種乙?；傅鞍?，SIRT1介導的自噬在細胞增殖、凋亡和抵抗細胞應激中同樣具有重要地位。如白藜蘆醇可通過SIRT1依賴的方式增強氧化型低密度脂蛋白誘導的受損自噬通量，并通過自噬-溶酶體途徑改善血管內皮細胞的自噬功能以保護其功能［12］。在急性胰腺炎小鼠模型體內外的研究中發現，溴結構域蛋白4（bromodomain containing 4，BRD4）能夠通過促進胰腺組織中SIRT1表達上調自噬通量，從而促進胰腺腺泡的損傷和促炎因子表達，而抑制BRD4介導的SIRT1表達能有效減輕疾病進展［30］。本實驗發現，SIRT1能顯著改善Hp誘導的自噬通量受損情況，即促進胃癌細胞中的自噬水平，同時還能顯著降低Hp誘導的促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-8釋放。其中TNF-α、IL-1β和IL-8是Hp感染相關炎癥研究較為廣泛的細胞因子，其在胃癌患者的血清和組織中均異常升高［31-32］。自噬與凋亡的動態演變是決定細胞生死存亡的兩個重要生理過程，最近的數據顯示，自噬的調節早于凋亡的發生，且自噬相關蛋白的表達與胃腸道腫瘤細胞的自噬性凋亡密切相關［33］。本研究表明，過表達SIRT1不僅能促進胃癌細胞凋亡，還可顯著削弱Hp感染引起的凋亡抑制作用，這可能與促凋亡相關蛋白Bad、cleaved caspase-9與cleaved-caspase-3的升高和凋亡抑制蛋白Bcl-2的降低有關。

綜上，本研究表明SIRT1在Hp陽性的胃癌組織中異常降低，且Hp感染能抑制胃癌細胞中SIRT1表達，而過表達胃癌細胞中的SIRT1能通過削弱Hp誘導的自噬通量受損現象上調細胞的自噬水平，從而促進胃癌細胞凋亡，并降低炎癥因子表達。后期課題組將在動物模型中進一步開展實驗來驗證上述結論，并深入探究SIRT1這一作用的相關分子機制，以期為Hp感染相關胃癌的預防及治療提供更有效的策略。