血清外泌體中miR-642a-3p下調HK1對胰島素分泌和兒童1型糖尿病進展的影響

邊青霞 牛春華 任志剛 （勝利油田中心醫院內分泌科，東營 257034）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一種伴有多種 并發癥的慢性內分泌疾病，是僅次于癌癥和心臟病的現代疾病中的第三殺手，在兒童中主要為經典1型糖尿?。╟lassic type 1 diabetes mellitus，T1DM）［1-2］。其發生的關鍵機制之一是自身免疫介導的胰腺β細胞受到破壞，繼而導致嚴重的胰島素缺乏，T1DM的高血糖可危及生命［3-4］。因此，有必要對T1DM的具體發病機制進行研究。

microRNAs（miRNAs）是一類長度為21～25個核苷酸的非編碼單鏈小RNA，其可通過與靶基因的mRNA特異性結合，在翻譯后水平調節基因表達，從而作用于細胞增殖、凋亡、分化和維持免疫系統細胞庫等［5-6］。越來越多的文獻報道miRNAs在自身免疫性疾病和T1DM中異常表達，可作為T1DM診斷和預后的生物標志物，調控高糖誘導的胰島β細胞死亡等細胞功能障礙并參與T1DM的發病過程［7-10］。既往研究證實血清外泌體miR-642a-3p在糖尿病腎病患兒中的表達顯著高于健康志愿者，可能是診斷和治療糖尿病腎病的候選分子［11］。但miR-642a-3p在兒童T1DM中可能發揮的功能尚未有相關報道。miRNAs在T1DM中的作用和調控機制復雜，本研究試圖尋找調節胰島β細胞凋亡的關鍵miRNA分子及其靶向的下游mRNA，探究其對兒童T1DM的影響，這對該病的防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 胰島素分泌細胞株MIN6購自美國ATCC菌種保藏中心；10%胎牛血清、DMEM培養液、胰蛋白酶購自美國Sigma公司；TaqMan miRNA RT kit試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自美國Invitrogen公司；PrimeScript RT試劑盒購自日本Ta-KaRa公司；Trizol試劑盒購自上海酶聯生物有限公司；抗體均由上海煊翎生物科技有限公司提供；紫外-可見光分光光度計（UV-1500）購自上海美析儀器有限公司；外泌體鑒定試劑盒購自翊圣生物；生物性透射電鏡購自日本Hitachi公司；雙熒光素酶質粒購自Promega公司；雙熒光素酶檢測儀器購自德國Berthold公司；血清血漿miRNA提取試劑盒購自新?；蛴邢薰荆煌饷隗w轉染Exo-FectExosome Transfection Kit購自美國SBI公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京碧云天生物；血清外泌體分離試劑盒購自北京普利萊基因有限公司；高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）、胰島素（insulin，Ins）ELISA試劑盒購自北京諾為生物。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 從NCBI數據庫獲取GEO芯片表達數據，選擇T1DM芯片GSE94649，使用limma包分析差異表達的miRNAs，差異篩選條件為adj.Pvalue＜0.05和|Log Fold Change|＞1。在TargetScan（http://www.targetscan.org/mamm_31/）網 站獲取miRNAs的下游靶基因。DisGeNET數據庫（https://www.disgenet.org/search）中查詢T1DM的風險基因。String數據庫（https://string-db.org）用于分析蛋白互作用關系。

1.2.2 血清樣本收集 將2018年1月至2020年 1月于勝利油田中心醫院兒科診室內分泌疾病代謝科就診、符合《中國1型糖尿病診治指南》診斷標準的T1DM患兒納入本試驗。收集納入對象的一般資料（年齡、性別）和血糖資料（自我指尖血糖檢測 值，單位mmol/L）。68例T1DM患兒中男36例，女32例，年齡3.5～17.2歲，平均（8.6±4.2）歲。選擇同期于勝利油田中心醫院體檢的健康兒童68例為對照組。兩組均行早晨空腹血樣采集，每位患者采血 10 ml。血清管于室溫下靜置30 min，隨后轉移至4 ℃條件下靜置4 h。移液器吸取淡黃色血清后轉移至離心管，3 000 g離心10 min。再次取上清轉移至離心管。-80 ℃凍存用于后續外泌體的提取。在試驗進行前研究對象及監護人均簽署知情同意書，本研究已獲得勝利油田中心醫院倫理審查委員會批準。

1.2.3 血清外泌體分離 將收集到的血清樣品與試劑盒中外泌體純化試劑以5∶1體積比充分混合，混勻后4 ℃孵育12 h。隨后1 500 g離心20 min收集外泌體沉淀后棄去上清液。再次離心5 min，吸除殘液，沉淀即為所需外泌體。隨后采用PBS重懸沉淀用進行后續試驗。

1.2.4 外泌體形態鑒定 采用120 kV生物透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察樣本中外泌體的形態結構和大小，首先將樣本滴加至銅網，1 min后濾紙吸干表面浮液，滴加1%醋酸氧鈾反應15 s后再次用濾紙吸去表面浮液。白熾燈下烤干后于TEM下觀察并拍照，外泌體通常為茶托型或一側凹陷的半球形，略小于100 nm且具有清晰的雙層囊膜結構。

1.2.5 外泌體標志蛋白檢測 在樣本中加入同體積的預冷裂解液冰上裂解15 min。轉移到4 ℃條件下12 000 g離心5 min后吸取上清液。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型），根據試劑盒說明書配制標準品和工作液進行蛋白定量檢測。隨后將樣本和試劑盒中的CD63&TSG101陽性對照品同時經10%SDS-PAGE電泳分離。轉至PVDF膜后于5%脫脂奶粉中常溫封閉1.5 h。加入一抗Anti-CD63抗體（1∶1 000～1∶2 000稀釋）、Anti-TSG101抗體（1∶500～1∶1 000稀釋），4 ℃下孵育過夜。次日漂洗后加入山羊抗鼠IgG抗體（1∶5 000～1∶10 000稀釋），室溫下孵育50 min后繼續漂洗。在最后1次漂洗的同時配制ECL發光工作液。將膜與ECL工作液充分接觸，室溫孵育3 min后瀝去工作液，壓片曝光5 s，顯影沖洗。采用Image J軟件測定各條帶灰度值。

1.2.6 外泌體轉染 采用Exo-FectExosome Transfection Kit試劑盒進行轉染。Exo-Fect可將核酸直接轉移至分離的外泌體中。將miR-642a-3p mimic、mimic-NC、miR-642a-3p inhibitor、inhibitor-NC分別與Exo-Fect試劑和分離得到的血清外泌體混勻，形成運載體，即可進行外泌體與靶細胞的共培養。轉染序列：miR-642a-3p inhibitor：5'-UACCGAGCAUUAUAUCCCAUCCACUAC-3'，inhibitor-NC：5'-AUCCGAUAACCCGAGACUUCCCAUCAC-3'，miR-642a-3p mimic：5'-UACCGAGCAUUAUAUCCCAUCCACUGC-3'，mimic-NC：5'-UACCCAAUGACCUACCUCUAGCUAUCU-3'。

1.2.7 細胞培養與轉染 胰島素分泌細胞株MIN6培養于RPMI1640培養基（10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、0.1 g/L鏈霉素和慶大霉素），37 ℃、5%CO2下培養，待細胞貼壁后棄去培養基，PBS清洗，0.25%胰蛋白酶消化后傳代。配制含3.7 mmol/L和25 mmol/L葡萄糖的KRB緩沖液。各組細胞吸棄原有培養基后，先用3.7 mmol/L的葡萄糖KRB緩沖液清洗后再加入500 μl進行孵育，設為未高糖培養組。2 h后吸棄，再次清洗并孵育0.5 h；或吸棄剩余緩沖液后加入25 mmol/L的葡萄糖KRB緩沖液孵育1 h，設為高糖培養組。將高糖培養基孵育的細胞進行相應轉染，轉染前1 d更換為不含胎牛血清的 RPMI1640培養基，分別將pcDNA3.1、pcHK1轉染至細胞，轉染6 h后更換RPMI1640完全培養基。轉染過程按照LipofectamineTM3000轉染試劑說明書進行。

1.2.8 外泌體的攝取 采用外泌體綠色熒光標記染料PKH67檢測高糖培養胰島β細胞對外泌體的吞噬作用。確定外泌體的蛋白量后，在避光條件下用試劑盒中的B液（Diluent C）稀釋A液（PKH67 linker）配制染料工作液。隨后加入外泌體中，渦旋振蕩2 min，靜置孵育15 min，復合物中加入10 ml的1×PBS混勻。提取外泌體去除染料，重懸沉淀物，即為染色后的外泌體。將胰島β細胞與熒光標記的外泌體共培養24 h，常規多聚甲醛溶液固定后加入DAPI染料進行核復染，熒光顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.9 雙熒光素酶分析報告試驗 根據生物預測網站預測的miRNA靶基因結合位點擴增靶基因3'UTR，插入熒光素酶報告基因質粒，構建突變型熒光素酶報告質粒。收集對數生長期的MIN6細胞，接種于24孔細胞培養板，分別將構建的野生型（wild type，WT）-HK1、突變型（mutant type，MUT）-HK1與miR-NC、miR-642a-3p mimic用Lipofectamine 3000轉染試劑共轉染至MIN6細胞，48 h后利用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測，螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性值即為報告基因熒光素酶活性。

1.2.10 流式細胞術 收集對數生長期高糖培養的胰島β細胞用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，2 000 g離心5 min后收集細胞，預冷的PBS洗滌2～3次，每次洗滌后均需再次離心。收集細胞后吸棄PBS，加入結合緩沖液重懸細胞，加入5 μl Annexin V-FITC染色液在2～8 ℃下避光孵育20 min，隨后加入10 μl PI染色液，混勻后再次避光孵育5 min，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率，激發波長為488 nm。

1.2.11 CCK-8 取對數生長期高糖培養的胰島 β細胞用0.25%胰酶消化，并接種于96孔板，在37 ℃、5%CO2條件下預培養。每孔加入10 μl CCK-8溶液，孔中保證無氣泡，隨后將細胞置于培養箱中繼續孵育2～3 h。酶標儀測定細胞在450 nm 處的吸光度（optical density，OD）值。細胞活性（%）=（實驗組OD值-空白組OD值）/對照組平均OD值×100%。1.2.12 GLP-1定量檢測 高糖培養的胰島β細胞上清液中GLP-1濃度采用雙抗體兩步夾心ELISA試劑盒測定。試驗步驟按試劑盒說明書嚴格操作，在450 nm波長處測定各孔OD值，以OD值為縱坐標（Y），相應的待測物質標準品濃度為橫坐標（X）繪制相應曲線，根據其OD值由標準曲線換算出待測樣品中GLP-1的相應濃度。

1.2.13 Ins分泌定量檢測 高糖培養的胰島β細胞上清液中Ins濃度的檢測采用雙抗體兩步夾心ELISA試劑盒進行。收集各組細胞上清液，上清液可在-80 ℃條件下冷藏放置，隨后3 000 g離心10～15 min，按照ELISA試劑盒測定Ins含量。采用酶標儀測定450 nm處的OD值。

1.2.14 qRT-PCR EP管中加入800 μl血清/血漿miRNA試劑與血清樣本混勻后于室溫條件下放置5 min，15 000 g離心5 min后將上清轉移至新的EP管，加入1 ml異丙醇并混合均勻。分3次加至吸附柱中并以15 000 g離心15 s，棄過柱液。加入75%異丙醇洗滌后再次離心15 s，棄過濾液。重復1次操作。吸附柱加入RnaseFree H2O，2 min后15 000 g離心2 min，洗脫產物即為提取的RNA。外泌體、細胞中RNA提取采用TRIzol法：吸棄培養液后加入PBS清洗。加入1 ml TRIzol裂解后吹打，裂解液轉移至EP管，室溫靜置5 min，加入0.2 ml氯仿，振蕩15 s至分層，12 000 g離心10 min，上清液轉移，加入同體積異丙醇。-20 ℃下靜置5 min，15 000 g離心10 min，吸棄上清。保留沉淀加入預冷的75%乙醇，混勻靜置，再次離心。加入RnaseFree H2O溶解總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA濃度和純度。隨后采用TaqMan miRNA RT kit 對miRNA進行反轉錄，該試劑盒通過3個poly-A拖尾法完成逆轉錄反應，借助試劑盒通用逆轉錄引物Oligo（dT）12-18擴增cDNA，HK1使用PrimeScript RT試劑盒完成逆轉錄反應，具體操作步驟依據試劑盒說明書進行。根據試劑盒說明書進行qRT-PCR實驗，以cDNA為模板，特異性引物為正向引物進行熒光定量PCR反應，miR-642a-3p以U6為內參，其余以GAPDH為內參。利用Real-Time PCR儀進行相應的PCR反應，計算采用2-ΔCt法，ΔCt=Ct目的基因-Ct內參。引物設計由上海吉瑪基因公司完成，見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR sequences

1.2.15 Western blot試驗檢測HK1蛋白表達 采用BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型），根據試劑盒說明書配制標準品和工作液進行蛋白定量檢測。加入Anti-HK1一抗（1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過夜。次日漂洗后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG（1∶5 000稀釋），室溫下孵育50 min后繼續漂洗。其余試驗操作同1.2.5。

1.3 統計學方法 運用統計學軟件SPSS24.0對實驗結果進行統計分析，數據用±s表示，組內兩兩比較使采用post-hoc檢驗，組間差異采用t檢驗或卡方檢驗表示，多組間比較采用單因素方差分析。受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線判斷診斷效率，比較曲線下面積（area under the curve，AUC）大小。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 經預測miR-642a-3p在T1DM中高表達 GSE94649芯片信息主要分析了T1DM患者血清中的差異表達miRNAs，該芯片中包含6例T1DM患者及6例健康人群的血清miRNAs信息。火山圖顯示，相對于健康人群，T1DM中差異表達的miRNAs有 4個，其中1個下調，3個上調（圖1A）。加載熱圖并結合以往文獻，最終選擇在T1DM患者血清中顯著高表達的miR-642a-3p作為本文研究對象（圖1B）。

圖1 miR-642a-3p在T1DM中差異表達Fig.1 miR-642a-3p was differentially expressed in T1DM

2.2 血清外泌體鑒定 經TEM觀察可見外泌體大小在60 nm左右且包膜完整，具有清晰雙層膜結構，為大小均一、單個分布或聚集成群的茶杯狀囊泡（圖2A）；Western blot檢測結果顯示TSG101與CD63均呈陽性（見圖2B，P＜0.05），經鑒定本研究成功分離血清外泌體。

圖2 血清外泌體鑒定Fig.2 Identification of serum exosomes

2.3 miR-642a-3p在T1DM患兒血清外泌體中表達顯著升高且與血糖濃度相關 qRT-PCR定量分析結果顯示，與對照組相比，miR-642a-3p在T1DM患者血清及血清外泌體中均呈高表達（圖3A、B，P＜0.05）。根據其在血清及血清外泌體中的表達進行ROC曲線分析結果發現，AUC分別為0.862 7、0.884 9（圖3C，P＜0.000 1），提示miR-642a-3p在T1DM中的表達對其診斷具有一定價值。

圖3 miR-642a-3p在T1DM兒童血清及血清外泌體中高表達Fig.3 miR-642a-3p was overexpressed in serum and serum exosomes in T1DM children

根據血清中miR-642a-3p的表達水平，以cut-off值（0.661 7）為界，將68例T1DM患兒分為高表達組（n=51）和低表達組（n=17）；根據血清外泌體中miR-642a-3p的表達水平，以cut-off值（2.235）為界，將 68例T1DM患兒分為高表達組（n=53）和低表達組 （n=15），分別分析miR-642a-3p在血清或血清外泌體中的表達水平與T1DM患兒一般資料、血糖指數的關系（表2、表3）。結果顯示，血清及血清外泌體中miR-642a-3p表達水平與血糖濃度相關（均P＜0.05），與年齡和性別均無明顯相關性（均P＞0.05）。

表2 T1DM患兒血清中miR-642a-3p的表達與一般資料、血糖指數的相關性分析Tab.2 Correlation analysis of miR-642a-3p expression in serum and general information， glycemic index in T1DM children

表3 T1DM患兒血清外泌體中miR-642a-3p的表達與一般資料、血糖指數的相關性分析Tab.3 Correlation analysis of miR-642a-3p expression in serum exosomes and general information， glycemic index in T1DM children

2.4 攜帶miR-642a-3p的血清外泌體能被胰島β細胞攝取，miR-642a-3p抑制劑能抑制T1DM進展 qRTPCR定量分析發現，相較于3.7 mmol/L Glucose組，miR-642a-3p在高糖處理的胰島β細胞中表達水平升高（圖4A，P＜0.05）。免疫熒光染色結果顯示，攜帶miR-642a-3p的血清外泌體可被高糖培養的胰島β細胞攝?。▓D4B）。與inhibitor-NC組相比，轉染miR-642a-3p inhibitor的外泌體中miR-642a-3p水平降低（圖4C，P＜0.05）。將外泌體與胰島β細胞共培養后發現，外泌體中的miR-642a-3p inhibitor可降低高糖培養胰島β細胞的凋亡率（圖4D，P＜0.05），促進其增殖活力（圖4E，P＜0.05），提高GLP-1水平 （圖4F，P＜0.05），同時促進高糖培養的胰島β細胞分泌Ins（圖4G，P＜0.05）。

圖4 血清外泌體源性miR-642a-3p促進T1DM的進展Fig.4 miR-642a-3p derived from serum exosomes accelerate progression of T1DM

2.5 HK1與miR-642a-3p存在結合位點，且miR-642a-3p能夠調控HK1表達 TargetScan靶向關系預測網站發現HK1與miR-642a-3p存在特異性結合位點（圖5A）；雙熒光素酶報告實驗結果表明，相對于miR-NC和WT-HK1共轉染組，miR-642a-3p和HK1共轉染組熒光素酶活性顯著降低（圖5B）。qRT-PCR和Western blot結果表明miR-642a-3p mimic可顯著抑制HK1的mRNA和蛋白表達（圖5C、D）；借助String數據庫將HK1與DisGeNET數據庫中獲取 的T1DM（C3495814）疾 病 風 險 基 因（GCG、

AMY2A、HLA-DQA1、CXCL10、IRF3、ITGAX、PLAAT4、ZBP1、CD68）進行蛋白互作分析，發現HK1和T1DM風險基因存在中度結合關系（圖5E），提示其可能作為miR-642a-3p的一個靶基因在T1DM的進展中發揮作用。

圖5 HK1是miR-642a-3p的一個靶基因Fig.5 HK1 was a target gene of miR-642a-3p

2.6 HK1能夠抑制T1DM進展 qRT-PCR定量分析和Western blot結果發現，相較于3.7 mmol/L Glucose組，HK1在高糖處理的胰島β細胞中mRNA和蛋白含量均降低（圖6A、B，P＜0.05）。將pcHK1轉染至高糖胰島β細胞共培養后發現，pcHK1能夠穩定高表達（圖6C，P＜0.05），過表達HK1可降低細胞凋亡率，增加細胞增殖活力、Ins分泌水平、GLP-1濃度（圖6D～G，P＜0.05），提示HK1能夠在一定程度上抑制高糖胰島β細胞的惡性表型。

圖6 HK1能夠抑制T1DM的進展Fig.6 HK1 can inhibit progression of T1DM

2.7 攜帶過表達miR-642a-3p的外泌體對胰島β細胞的作用被HK1部分挽救 將轉染miR-642a-3p mimic的外泌體與高糖胰島β細胞共培養，與mimic-NC組相比，miR-642a-3p mimic組高糖胰島β細胞中miR-642a-3p水平升高（圖7A，P＜0.05），凋亡率升高（圖7B，P＜0.05），增殖活力、GLP-1濃度降低（圖7C、D，P＜0.05），Ins分泌減少（圖7E，P＜0.05）；將轉染miR-642a-3p mimic的外泌體與過表達HK1的高糖胰島β細胞共培養后發現，相較于miR-642a-3p mimic+pcDNA3.1組，過表達HK1 miR-642a-3p水平降低（圖7A，P＜0.05），過表達HK1能降低細胞凋亡率，提高細胞增殖活力、Ins分泌水平、GLP-1濃度（圖7B～E，P＜0.05）。

圖7 miR-642a-3p對胰島β細胞的作用被HK1部分挽救Fig.7 Effects of miR-642a-3p on islets β cells was partially saved by HK1

3 討論

既往研究發現miRNAs在血清中的表達在T1DM患者中發生改變，血清miRNAs水平與T1DM的葡萄糖穩態和胰島自身抗體有關［12-13］。OUNI等[14]報道了miR-205在糖尿病易感小鼠胰島中表達上調，參與DM的發生發展。因此本研究通過篩查血清中差異表達的miRNAs試圖尋找有前途的疾病生物標志物，通過對芯片的差異分析找到了在T1DM患者血清中顯著上調的miR-642a-3p。qRT-PCR檢測結果進一步證實miR-642a-3p同時在T1DM血清及血清外泌體中高表達。隨后將miR-642a-3p作為本研究的切入點，試圖驗證miR-642a-3p作為全新的靶向T1DM的生物分子靶點的可能。

外周血、脂肪來源外泌體中穩定攜帶的特異生物信息可通過調控胰島素敏感性、葡萄糖穩態或血管內皮功能影響T1DM進展，而胰島素能由胰島 β細胞合成分泌［15-16］。一些外泌體中的miRNAs能夠介導胰腺β細胞凋亡，并可能影響T1DM的發生［17］。此前miR-299-5p被證明是β細胞生物學的重要調節因子，對胰腺β細胞功能和存活具有顯著調節作用［18］。另外miR-149負調控MafA基因參與亞砷酸鹽誘導的胰島β細胞胰島素合成分泌功能障礙［19］。本研究結果表明，血清外泌體中miR-642a-3p高表達，推測其對高糖培養的胰腺β細胞株MIN6具有調控作用。本研究隨后分析其改善細胞凋亡和功能障礙的可能作用機制，并探討了其在此過程中的調控作用，結果發現抑制miR-642a-3p能夠促進MIN6細胞增殖活力，抑制其凋亡。GLP-1是一種強有力的胰島素促分泌劑，可增強葡萄糖刺激的胰島素分泌［20］。GLP-1水平下降會導致代謝綜合征，miR-194能降低GLP-1水平，并加劇GLP-1缺乏引起的代謝失調，GLP-1缺乏會導致促炎細胞因子上調，進而導致β細胞功能障礙和凋亡［21-22］。因此，本課題組同時測定了GLP-1的表達，結果發現抑制miR-642a-3p可促進GLP-1表達，改善GLP-1缺乏導致的代謝障礙，從而促進胰島素分泌。

為進一步探究miR-642a-3p對T1DM的具體作用機制，本研究通過生物信息手段篩選出miR-642a-3p的下游靶基因，并將HK1納入后續研究。HK1是一種葡萄糖利用相關蛋白，十二指腸-空腸搭橋術通過激活胰島素信號和改善大腦中的葡萄糖利用率改善糖尿病進展，HK1作為葡萄糖利用酶在治療后表達升高［23］。二甲雙胍可阻斷糖尿病小鼠心臟中HK1下調，增加糖尿病心臟對葡萄糖的利用，從而對心臟發揮保護作用［24］。本研究利用雙熒光素酶分析報告實驗證實了miR-642a-3p與HK1的靶向關系，提出miR-642a-3p通過負調控HK1表達影響胰島β細胞相應功能。將MIN6細胞轉染相應的過表達載體后，通過將攜帶miR-642a-3p不同轉染載體的外泌體與之共培養后進行一系列的功能試驗和挽救實驗。結果顯示，過表達miR-642a-3p對胰島 β細胞功能具有損害作用，其加重T1DM的影響能夠被過表達HK1部分挽救。

綜上所述，本課題組認為miR-642a-3p在T1DM患兒血清和血清外泌體中表達上調，且可通過靶向HK1調控高糖誘導的胰島β細胞增殖和凋亡，血清外泌體中miR-642a-3p為T1DM的驅動因子，可抑制MIN6細胞中GLP-1表達，進而抑制高糖胰島β細胞胰島素分泌。本研究初步揭示了miR-642a-3p作為一種新的T1DM診斷和治療生物標志物的可能，為今后T1DM的治療和預防研究提供重要線索。