抗阿爾茨海默病重組腺相關病毒的制備與活性研究①

張 宇 王迪齊 付 璐 （吉林農業大學生命科學學院，長春 130118）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種漸行性神經退行性疾病，是世界上最常見的癡呆形式之一［1-2］。預計到2050年，世界患病人數將達到15 200萬例［3］。面對如此嚴峻的形勢，目前尚無藥物可有效治愈AD［4］。最新研究表明，高度磷酸化的微管結合蛋白即Tau蛋白（phosphorylated Tau，p-Tau）可能是AD的主要致病物質之一［5］。Tau蛋白的高度磷酸化使其喪失了基本生理功能，導致細胞骨架結構變化，使神經元突觸功能喪失并發生神經元的退行性病變，從而導致AD發生［6-7］。因此，利用免疫療法清除腦中的p-Tau有望成為治療AD的有效手段之一。

2011年，BOUTAJANGOUT等［8］首次報道了以p-Tau蛋白為靶點的AD被動免疫療法，該研究利用能夠識別Tau蛋白磷酸化Ser396/Ser404殘基的抗體對AD模型鼠進行免疫，可減少小鼠腦中Tau蛋白沉積，并且能夠延緩小鼠運動機能障礙。1985年BINDER等［9］通過收集BALB/c小鼠腹水制備了AT8單克隆抗體，該抗體可與牛和大鼠腦中p-Tau結合。1992年BIERNAT等［10］研究發現AT8單克隆抗體可識別AD致病性p-Tau的所有亞型。隨后的眾多研究表明AT8單克隆抗體可有效識別ser202和thr205位點［11-13］。因此，AT8成為潛在的治療AD的抗體藥物，并被廣泛研究。雖然靶向p-Tau的免疫療法已經取得了一定進展，但依舊存在一些問題。如治療型全抗體的相對分子質量較大，難以透過血腦屏障，很難直接作用于腦內致病物質，治療效果有限。此外，抗體的半衰期較短，AD的治療需要進行長期頻繁的抗體注射，降低了患者的順應性。因此，本研究以AT8為基礎，設計新型的AD免疫療法。

單鏈抗體（single chain fragment variable，scFv）是一種基因工程抗體，只含有抗體重鏈及輕鏈的可變區［14］。由于其相對分子質量較小，相比于全抗體，能夠更好地透過血腦屏障，在AD治療領域具有獨特優勢。腺相關病毒（adeno-associated virus， AAV）是一種小型無包膜病毒，由于其安全性好、免疫原性低、在體內表達外源基因時間長等特點，成為應用較為廣泛的基因治療載體之一［15-16］。其中，8型腺相關病毒具有感染范圍廣、轉導效率高的特點，是外源抗體表達的優選載體［17-19］。本研究設計了一種新型AD免疫療法，在AT8的基礎上，設計構建其單鏈抗體AT8-scFv，并以8型腺相關病毒為載體，對其在體內進行長時間表達。這種新型免疫療法解決了全抗體血腦屏障透過率低、抗體半衰期短的問題。本研究構建獲得重組腺相關病毒AAV8-AT8-scFv，并對其體內外活性進行檢測，為AD的免疫療法提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎上皮細胞293T、載體pET20b、pAAV8、RC8、pHelper質粒由吉林農業大學生命科學學院免疫藥物研發及產業化科研團隊提供；BALB/c小鼠（遼寧長生生物技術股份有限公司）；Anti-His單克隆抗體、AP標記鼠二抗、HRP標記鼠二抗（北京博奧森生物技術有限公司）；p-Tau多肽由吉爾生化上海有限公司合成；Lipo293FTM轉染試劑（上海碧云天生物技術有限公司）；其他常規試劑均為進口或國產分析純。小動物活體成像系統（IVIS Lumina Ⅱ，Caliper公司）。

1.2 方法

1.2.1 AT8-scFv的表達與純化 查找PDB數據庫獲得AT8-scFv的氨基酸序列，通過基因合成方式獲得AT8-scFv的基因片段，并將其構建到pET20b載體上。大腸桿菌原核表達系統對AT8-scFv進行表達，鎳柱親和層析對AT8-scFv進行純化，獲得純化的單鏈抗體。

1.2.2 SDS-PAGE與Western blot 配制13.5%SDSPAGE凝膠，對樣品進行分離檢測。然后利用電泳半干轉化儀，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜。牛奶溶液封閉后，Anti-His單克隆抗體孵育2 h，隨后利用AP標記鼠二抗孵育，NBT/BCIP進行顯色。

1.2.3 ELISA法檢測AT8-scFv濃度 以p-Tau包被96孔板（100 ng/孔），4 ℃過夜后洗去包被物。隨后用封閉液（含2%BSA的PBS溶液） 37 ℃封閉1 h。棄去封閉液，加入不同稀釋梯度的AT8-scFv蛋白 （1∶100～1∶1 600兩倍稀釋）或不同稀釋梯度的小鼠血清（1∶100～1∶1 600兩倍稀釋） 37 ℃孵育2 h。棄去板中液體，每孔加入Anti-His單克隆抗體，37 ℃孵育2 h。棄去板中液體，用HRP標記的鼠二抗37 ℃孵育2 h，孵育完成后，洗板并加入底物避光顯色。顯色完成后，2 mol/L硫酸終止反應，在450 nm波長處檢測OD值，OD值＞2倍背景值視為陽性結果。

1.2.4 重組腺相關病毒的包裝與純化 本研究采用三質粒轉染系統對病毒進行包裝。首先構建能夠表達AT8-scFv的AAV表達質粒pAAV8-AT8-scFv以及表達紅色熒光蛋白的對照質粒pAAV8-RFP。隨后對表達質粒、輔助質粒pHelper及AAV8骨架質粒RC8進行大量提取，去內毒素后凍存備用。

擴增293T細胞，待細胞密度達到70%～80%時，利用脂質體轉染試劑進行三質粒共轉染（具體操作參見轉染試劑說明書）。轉染完畢后，繼續培養72 h，收取病毒。無菌條件下收取轉染后細胞，并轉入無菌離心筒。加入轉出液1/10體積的氯仿，37 ℃、220 r/min振蕩1 h。4 ℃、12 000 r/min離心 15 min后取水相，加入無菌NaCl-PEG溶液。搖勻后冰浴1 h，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清，無菌PBS重懸溶解后轉移至EP管中，加入Rnase和Dnase，隨后加入氯仿，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上清，獲得純化后的病毒。

1.2.5 重組腺相關病毒AAV8-AT8-scFv感染能力測定 293T細胞培養于6孔板，待細胞密度達到90%左右，加入100 μl滴度為1×1012vg/ml的AAV8-AT8-scFv進行感染。感染后72 h收取細胞并裂解，Western blot檢測AT8-scFv表達情況。

1.2.6 免疫方案設計 30只8周齡BALB/c雌性小鼠分為3組（陰性對照生理鹽水組、病毒對照AAV8-RFP組、實驗組AAV8-AT8-scFv），10只/組。在第0周進行左大腿肌肉注射免疫，劑量為：生理鹽水100 μl，AAV8-RFP和AAV8-AT8-scFv注射100 μl滴度為1×1012vg/ml的病毒。每周對小鼠進行采血，檢測血清中AT8-scFv含量。

1.2.7 小動物活體成像 在第0、2、4、8周分別處死1只生理鹽水組與AAV8-RFP組小鼠，分離腿部組織，并去掉皮毛，進行活體成像觀察。實驗條件為：激發波波長587 nm，發射波波長610 nm。

1.3 統計學處理 采用SPSS統計軟件對數據進行分析，組間比較采用t-檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 AT8-scFv的表達與純化 本研究成功獲得AT8-scFv蛋白。其SDS-PAGE和Anti-His Western blot結果圖1所示。蛋白大小約為25 kD，純度達到95%以上。

圖1 AT8-scFv的表達與純化Fig.1 Expression and purification of AT8-scFv

2.2 AT8-scFv在體外與p-Tau具有較好的結合活性 ELISA檢測AT8-scFv與p-Tau的結合活性，結果如圖2所示。AT8-scFv能夠與p-Tau相結合，其結果在1∶400的稀釋梯度下依舊呈陽性。提示AT8-scFv較好地保留了其全抗體的結合能力，在AD的治療方面具有研究價值。

圖2 ELISA法檢測AT8-scFv與p-Tau的結合活性Fig.2 ELISA assay to determine binding activity of AT8-scFv to p-Tau

2.3 重組腺相關病毒的包裝與純化 本研究成功構建了AT8-scFv的表達質粒pAAV8-AT8-scFv及紅色熒光蛋白的表達質粒pAAV8-RFP，并利用293T細胞和三質粒轉染系統對AAV8-AT8-scFv、AAV8-RFP進行包裝與純化。SDS-PAGE檢測病毒的包裝情況，結果如圖3所示。AAV8-AT8-scFv與AAV8-RFP包裝成功，其中3個衣殼蛋白VP1、VP2、VP3的含量比例約為1∶1∶10。RT-qPCR檢測病毒滴度，AAV8-AT8-scFv的滴度為3.9×1012vg/ml，AAV8-RFP的滴度為2.8×1012vg/ml。

圖3 AAV8-AT8-scFv衣殼蛋白的SDS-PAGE電泳檢測Fig.3 SDS-PAGE analysis of capsid proteins of AAV8-AT8-scFv

2.4 重組腺相關病毒具有較好的感染與表達能力 利用293T細胞檢測重組病毒感染能力與表達能力，結果如圖4所示。圖4A為AAV8-RFP的感染熒光觀察結果，隨著感染時間延長，紅色熒光逐漸加強，并在72 h時達到高峰。圖4B為AAV8-AT8-scFv感染后表達能力檢測結果，Western blot結果顯示AAV8-AT8-scFv能夠很好地表達AT8-scFv，且表達量較高。

圖4 rAAV感染及表達能力檢測Fig.4 Detection of infection and expression ability of rAAV

2.5 重組腺相關病毒AAV8-AT8-scFv能夠在小鼠體內長時間表達單鏈抗體 小動物活體成像觀察重組腺相關病毒AAV8-RFP在小鼠體內的感染與表達情況，結果如圖5所示。病毒注射2周后開始在體內表達，8周時表達范圍幾乎覆蓋全腿。ELISA法檢測AAV8-AT8-scFv免疫組小鼠血清中AT8-scFv含量，用已知濃度的AT8-scFv為標準品制作標準曲線，進行濃度計算。實驗結果如圖6所示，在免疫后2周左右，AT8-scFv開始在血液中出現，隨著時間延長，抗體濃度逐漸增加。抗體濃度在第8周達到高峰，隨后抗體濃度穩定在20 μg/ml左右。提示AAV8-AT8-scFv在體內具有非常好的表達能力，能夠對單鏈抗體進行長時間表達，表達時間至少能夠持續3個月。

圖5 小動物活體成像檢測rAAV在小鼠體內表達情況Fig.5 Expression ability of rAAV in mice using vivisection imaging system

圖6 ELISA檢測AT8-scFv在小鼠血清中的濃度Fig.6 Serum concentration of AT8-scFv was detected by ELISA

3 討論

AD是一種復雜的多因素疾病，目前尚無有效手段延緩其疾病進程［13］。繼淀粉級聯假說后，p-Tau蛋白作為AD的主要致病物質之一，逐漸成為研究焦點，靶向Tau蛋白的免疫療法更是前景廣闊［20］。2017年WEST等［21］開發了一種人源化Tau抗體 （ABBV-8E12），該抗體于2021年完成了針對輕度AD患者的Ⅱ期臨床試驗，試驗結果顯示ABBV-8E12具有良好的安全性和有效性［22］。此外，BIIB092是人源化的IgG4單克隆Tau抗體，QURESHI等［23］對BIIB092進行了臨床研究，該抗體表現出良好的安全性和耐受性，且對p-Tau的抑制程度呈劑量依賴性。雖然靶向Tau蛋白的被動免疫療法已經取得了很大進展，但傳統的全抗體治療方式依舊存在很多弊端。如全抗體分子量大、血腦屏障透過率低、安全性差、半衰期短等，都限制了其應用［24］。如何設計開發一種安全有效的AD免疫療法成為研究者目前迫切的需求。

本研究設計了一種新型靶向p-Tau的AD免疫療法。在治療型抗體AT8的基礎上，對其進行改造，獲得其單鏈抗體AT8-scFv，并利用AAV8對其在體內進行長時間表達。本研究成功獲得了能夠表達AT8-scFv的重組腺相關病毒AAV8-AT8-scFv，并對其理化性質進行了表征。體外實驗結果顯示，其具有較好的感染能力，所表達的抗體AT8-scFv具有較強的結合活性。本研究以小鼠為動物模型，探究其體內表達情況。結果顯示，該重組腺相關病毒能夠在體內對AT8-scFv進行長時間表達。在下一步的實驗中，課題組將繼續對重組病毒進行優化，提高其表達量，延長其表達時間。隨后利用AAV8-AT8-scFv對不同年齡段的AD模型鼠進行治療，進一步探究該免疫療法對AD模型小鼠的神經保護作用，為AD的新型免疫療法奠定基礎。