自身免疫性疾病自身抗原的研究進展①

羅秀娜 任 軍 賈凌云 姬芳玲 （大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院，大連 116024）

1 自身免疫性疾病

自身免疫性疾病（autoimmune diseases，AD）與許多復(fù)雜疾病一樣，是遺傳和環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致的固有免疫和適應(yīng)性免疫功能紊亂，最終導(dǎo)致機體發(fā)病。AD曾被歸類為罕見病的一種，但流行病學(xué)研究表明AD發(fā)病人數(shù)已占全球總?cè)丝诘?%～5%，患病人數(shù)眾多且逐年上升［1］。目前仍未確定導(dǎo)致AD發(fā)生的確切因素，因此AD仍是研究熱點。目前，AD診斷多依賴于血清自身抗體的檢測，針對自身抗原的自身抗體大量產(chǎn)生，二者結(jié)合形成致病性免疫復(fù)合物沉積于局部導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。因此，自身抗原是引發(fā)AD的關(guān)鍵因素，確定自身抗體的作用靶點——自身抗原，對AD診斷、治療及預(yù)防意義重大。

AD可分為兩類，一類是器官特異性AD，如原發(fā)膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）、1型糖尿病（type 1 diabetes，T1D）及由B細胞和T細胞介導(dǎo)的甲狀腺功能亢進等，其特征為當免疫應(yīng)答針對位于特定器官中的自身抗原時，參與慢性炎癥性疾病發(fā)展的自身免疫過程，表現(xiàn)出器官特異性［2］；另一類是系統(tǒng)性AD，如免疫網(wǎng)絡(luò)失衡的銀屑病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）等，其特征為多器官受累，可能由自身抗原系統(tǒng)性分布引起。

2 自身抗原

自身過敏物質(zhì)或變性自身蛋白可作為自身抗原激發(fā)免疫應(yīng)答，通過隱蔽抗原釋放，自身組織成分因感染、藥物、輻射發(fā)生變性被修飾而形成。許多自身抗原是多分子復(fù)合物的重要組成，廣泛分布于大分子團簇。正常情況下，自身抗原不會激活免疫系統(tǒng)。但體細胞突變/損傷，或半抗原與蛋白等載體彼此結(jié)合可引發(fā)這些自身抗原構(gòu)象表位變化。免疫系統(tǒng)對自身抗原的反應(yīng)性增強，導(dǎo)致免疫耐受破壞，引發(fā)由T細胞和B細胞介導(dǎo)的自身免疫應(yīng)答。T細胞可引起效應(yīng)細胞毒性反應(yīng)，B細胞可分化為漿細胞產(chǎn)生針對自身抗原的特異性抗體。效應(yīng)細胞和抗體靶向表達自身抗原組織，并導(dǎo)致組織損傷。同時，自身蛋白經(jīng)修飾也可誘導(dǎo)病理性自身抗體產(chǎn)生，誘發(fā)AD［3］。

臨床診斷發(fā)現(xiàn)，AD在不同階段所檢測的自身抗體有一定特征性，如SLE患者癥狀出現(xiàn)前，體內(nèi)長時間存在的自身抗體為抗核抗體、抗La抗體、抗Ro抗體和抗磷脂抗體，發(fā)病時的自身抗體為抗Sm抗體、抗核糖核蛋白抗體及抗雙鏈DNA抗體［4］。其他AD，如T1D和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）中，也觀察到癥狀發(fā)展前表現(xiàn)識別自身抗原的免疫應(yīng)答，亞臨床自身免疫先于臨床發(fā)病數(shù)年［5-6］。因此，在患者癥狀表現(xiàn)前對自身抗原的探究可有效輔助早期AD診斷。此外，AD發(fā)病機制繁雜，并非所有AD均有明確的自身抗體，有些涉及炎癥細胞因子、表位擴散、樹突狀細胞凋亡等病理機制。本節(jié)將對各種AD的主要自身抗原進行歸納介紹，說明自身抗原在AD發(fā)病進程中的角色。

研究表明針對器官特異性自身免疫過程的自身抗原通常受組織限制，如重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）中乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AChR）組成部分，而系統(tǒng)性自身免疫過程的自身抗原通常是在多種細胞類型和組織中普遍表達的抗原［7-8］。

對器官特異性AD，自身抗體靶向特定器官或組織的自身抗原，且靶向頻率較高。自身抗原的探究對AD診斷具有良好輔助作用，多數(shù)器官特異性AD均有特異性較高的受體抗原參與。近年受體抗原研究不斷深入，以下將介紹致病性受體抗原在發(fā)病進程中參與較多，且發(fā)病率逐年上升的器官特異性AD。格雷夫斯病（Graves' disease，GD）又稱毒性彌漫性甲狀腺腫，是一種針對甲狀腺細胞表面促甲狀腺激素受體（thyroid stimulating hormone receptor，TSHR）自身抗原的自身免疫介導(dǎo)的器官特異性AD，累及患者甲狀腺與眼部，主要表現(xiàn)為刺激性抗TSHR抗體引起的甲狀腺功能亢進［9-10］。TSHR是糖蛋白偶聯(lián)激素受體家族成員，由細胞外結(jié)構(gòu)域（ECD）、跨膜結(jié)構(gòu)域（7TMD）和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域三部分組成［11］。TSHR可調(diào)節(jié)促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone， TSH）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并產(chǎn)生甲狀腺激素。研究發(fā)現(xiàn)遺傳-表觀遺傳相互作用，涉及TSHR基因中的非編碼區(qū)SNP，SNP導(dǎo)致胸腺中TSHR基因表達降低并促進TSHR反應(yīng)性T細胞逃避中樞耐受性和自身免疫性，觸發(fā)GD［9］。同時，TSHR的胞外結(jié)構(gòu)域（TSHR-ECD）蛋白通過抗原呈遞細胞加工成TSHRECD肽與HLA Ⅱ類分子結(jié)合，形成的復(fù)合物呈遞給CD4+T細胞，刺激B細胞產(chǎn)生抗TSHR抗體的細胞因子或趨化因子，引發(fā)甲亢［10］。

MG主要累及神經(jīng)肌肉接頭突觸后膜AChR，患者癥狀表現(xiàn)為肌肉無力和易疲勞［12］。AChR由2個α和β、γ、δ各1個的亞單位形成穿過細胞膜的通道。乙酰膽堿識別突觸后膜AChR的2個α部位形成肌肉終板電位，電位達到閾值時產(chǎn)生動作電位，從而促進肌肉正常收縮。當其自身抗體與突觸后膜AChR結(jié)合，突觸后連接處下游信號干擾降低了終板電位達到觸發(fā)動作電位所需閾值的能力，最終產(chǎn)生肌肉無力的臨床癥狀［13］。

特發(fā)性膜性腎病（idiopathic membranous nephropathy，IMN）是一種抗體介導(dǎo)的自身免疫性腎小球疾病，主要自身抗原為磷脂酶A2受體（phospholipase A2receptor，PLA2R）、含7A的血小板反應(yīng)蛋白-Ⅰ型結(jié)構(gòu)域（thrombospondin type 1 domain-containing protein 7A，THSD7A）、外泌素1（exostosin 1， EXT1）和外泌素2（exostosin 2，EXT2）［14-15］。IMN中免疫復(fù)合物由主要結(jié)合2種自然表達的足細胞抗原PLA2R和THSD7A之一的循環(huán)抗體形成［14］。2009年，BECK等［16］研究表明M-型磷脂酶A2受體（M-type phospholipase A2receptor，PLA2R1）是IMN的靶抗原。PLA2R1分子量約為180 kD，存在于人正常足細胞，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)僅由42個氨基酸殘基組成，95%以上屬于胞外結(jié)構(gòu)。PLA2R1占病例的70%，且抗PLA2R1抗體在非IMN患者及健康組中很少出現(xiàn)，表明抗PLA2R1抗體是區(qū)分IMN與其他類型腎病的良好生物標志物［16］。2014年，第二種自身抗原THSD7A被發(fā)現(xiàn)，研究顯示THSD7A占其他膜性腎病病例的5%～10%［17］。與PLA2R類似，THSD7A是足細胞表達的分子量為250 kD的Ⅰ型跨膜蛋白，由1個大的細胞外N末端結(jié)構(gòu)域、1個單程跨膜結(jié)構(gòu)域和1個短的細胞內(nèi)C末端結(jié)構(gòu)域組成［18］。盡管THSD7A聚集在膜內(nèi)的能力尚不確定，但也可能在近膜位點被裂解，其胞外多個TSR區(qū)域可能增強與腎小球基底膜結(jié)合，形成上皮下沉積物［19］。SETHI等［20］鑒定了EXT1和EXT2蛋白的膜上沉積物，尤其是PLA2R和THSD7A陰性的IMN和自身免疫相關(guān)MN患者中，提示EXT1和EXT2可能是約20%IMN患者（PLA2R和THSD7A陰性患者）的自身抗原。

系統(tǒng)性AD抗原分布具有全身性，可由多種自身抗原作為自身免疫反應(yīng)靶標。免疫系統(tǒng)特異性靶向有限的一組普遍表達的自身抗原導(dǎo)致自身免疫，從而引發(fā)AD。SLE是一種多發(fā)于青年女性的慢性全身性AD，其主要自身抗原為細胞核、雙鏈DNA、Sm、核糖核蛋白、Ro52、DNA、La、細胞內(nèi)氯離子通道蛋白2、核小體、B細胞激活因子等。細胞核抗原是SLE中靶向頻率最高的自身抗原；Ro52蛋白通過IL-23-Th17通路負向調(diào)節(jié)促炎細胞因子表達，減少組織炎癥和系統(tǒng)性自身免疫反應(yīng)發(fā)生［21］；B細胞激活因子抗體可能是高水平干擾素IFN-α驅(qū)動的SLE副產(chǎn)物，或是SLE患者攜帶的一種獨特亞群標志物。

RA是一種好發(fā)于中老年女性的全身性AD，病變主要累及關(guān)節(jié)。免疫系統(tǒng)增殖的T細胞激活B細胞和巨噬細胞誘導(dǎo)細胞因子產(chǎn)生，促炎和抗炎細胞因子失衡誘發(fā)自身免疫，從而引起慢性炎癥導(dǎo)致關(guān)節(jié)受損，關(guān)節(jié)破壞日益嚴重導(dǎo)致程度不等的功能障礙和畸形［22］。RA的主要自身抗原為肽基精氨酸-脫亞氨酶-4和瓜氨酸化蛋白（瓜氨酸纖維蛋白、波形蛋白、纖維結(jié)合素、膠原Ⅱ等）。RA患者炎癥滑液環(huán)境中檢測到瓜氨酸化蛋白高度活躍，具有自身抗原性抗瓜氨酸化蛋白抗體與這些蛋白的瓜氨酸殘基特異性結(jié)合導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷。近年研究還發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)可通過識別RA患者血清IgG的糖鏈N末端半乳糖（galactose，Gal）缺失體（IgG0糖鏈自身抗原）產(chǎn)生自身抗體，該自身抗體可與IgG0形成免疫復(fù)合物，沉積在關(guān)節(jié)腔內(nèi)導(dǎo)致機體炎癥反應(yīng)［23］。同時一些新型自身抗原，如視黃醇結(jié)合蛋白1類似蛋白（RBP1 like protein，Rbik）、糖蛋白-39（glycoprotein-39）和鈣蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin）等也將有望為RA診療提供新的靶點［24］。

干燥綜合征（Sj?gren syndrome，SS）是一種累及人體外分泌腺的系統(tǒng)性AD，分為原發(fā)性（pSS）和繼發(fā)性兩類，由B細胞和T淋巴細胞介導(dǎo)的針對某些抗原的反應(yīng)觸發(fā)［25-26］。主要自身抗原為SS A型抗原（Ro）和SS B型抗原（La）、水通道蛋白、碳酸酐酶、 細胞核成分（RPN）與細胞核、毒蕈堿受體（muscarinic receptors，M1R-M5R）、激肽釋放酶的小型血漿肽酶、血管活性腸肽、血小板-選擇素等［27］。Ro是pSS中靶向頻率最高的自身抗原；M3R刺激的免疫應(yīng)答可能使M3R信號傳導(dǎo)途徑失敗，最終導(dǎo)致pSS發(fā)展［28］；血管活性腸肽與靶細胞（如免疫細胞、平滑肌等）的血管活性腸肽受體1和2結(jié)合，抑制TNF-α和IL-6等促炎細胞因子，并上調(diào)抗炎細胞因子IL-10［29-30］；水通道蛋白和碳酸酐酶可能分別靶向淚腺和唾液腺導(dǎo)致淚液和唾液生成減少［31］。其他AD自身抗原見表1， 根據(jù)已發(fā)表文章收集了AD已建立的自身抗原。

表1 AD的主要自身抗原Tab.1 Major autoantigens in AD

3 抗原特異性免疫治療AD

目前AD治療主要基于免疫抑制藥物、維生素、微量元素等。傳統(tǒng)激素和免疫抑制藥物在緩解臨床癥狀和保護機體正常功能方面不良反應(yīng)高，藥效不明顯。如糖皮質(zhì)激素是AD治療中廣泛使用的藥物，能減少促炎因子轉(zhuǎn)錄和表達，發(fā)揮抗炎作用，但低劑量使用效果不明顯，高劑量藥物積累會介導(dǎo)免疫復(fù)合物沉積，調(diào)節(jié)淋巴細胞增殖誘導(dǎo)細胞凋亡，導(dǎo)致自身免疫損傷［38］；一些免疫抑制劑僅對部分表型疾病起作用，如膽堿酯酶抑制劑是AChR-Ab陽性患者的重要治療藥物，可使肌無力癥狀得到暫時緩解，但無法完全消除癥狀及阻止病情進展，且高劑量膽堿酯酶可加重該型肌無力癥狀，MG患者或其他AD患者中，長期使用免疫抑制劑有增加惡性腫瘤發(fā)生的趨勢［39］。同時，一些單抗類藥品價格昂貴且完全緩解率較低，有效臨床樣本量小。這些免疫療法缺乏特異性，副作用明顯，在治療上仍有弊端［40］。為優(yōu)化AD治療，抗原特異性免疫治療已被提出，并在動物模型中取得較大進展。自身抗原療法可使用完整自身抗原蛋白或來自這些抗原的肽［41］。治療的有效性很大程度上取決于候選自身抗原的選擇、給藥時間及給藥途徑。這些自身抗原肽可單獨使用，也可與其他藥劑聯(lián)用。與目前使用的誘導(dǎo)全身性免疫抑制的非特異性療法相比，抗原特異性免疫治療靶向B細胞或T細胞的有限組織，因此不會損害機體的正常免疫應(yīng)答和宿主防御能力［42］。

1990年以來已使用自身抗原療法進行多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）的變異研究，利用抗原偶聯(lián)的細胞耐受策略治療MS患者，并已在人類首次公開登記的單中心臨床試驗中證明了其安全性和良好耐受性［43］。MG、SLE、RA中也嘗試過自身抗原治療，有研究描述對非自身免疫小鼠模型使用了一種與SLE患者天然存在的抗雙鏈DNA抗體發(fā)生交叉反應(yīng)的合成肽，該肽抑制了抗雙鏈DNA抗體在腎小球中沉積，從而減輕了組織損傷［44-45］。類似肽的多聚體形式免疫可提高小鼠血清抗雙鏈DNA抗體水平，狼瘡小鼠模型中，自身表位核小體組蛋白肽H416-39治療抑制了自身反應(yīng)性T細胞和B細胞并延遲了病情發(fā)展，表明蛋白肽可誘導(dǎo)自身抗原特異性耐受［46］。這些小鼠中，其他組蛋白自身表位也可誘導(dǎo)耐受性，降低自身抗體水平，延長壽命［47］。

RA患者表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹，關(guān)節(jié)壓痛等癥狀，傳統(tǒng)激素及免疫抑制藥物缺乏對癥專一性，可能引起骨質(zhì)疏松、糖尿病、動脈粥樣硬化、腎功能障礙、瘀傷、感染等多種并發(fā)癥［38］。自我耐受性破壞產(chǎn)生具有致病作用的類風(fēng)濕因子和抗瓜氨酸化蛋白抗體（ACPA），導(dǎo)致疾病發(fā)生［48］。靶向瓜氨酸化自身抗原是RA的特征，已發(fā)現(xiàn)在人類嗜中性粒細胞中誘導(dǎo)細胞超瓜氨酸化刺激物是通過免疫介導(dǎo)的膜溶解途徑進行的（圖1）。自身抗原肽單獨或與其他顆粒和多聚肽療法組合使用可能會阻止易感患者發(fā)展為RA。ACPA激活骨髓細胞活化并可誘發(fā)其死亡，利用抗原特異性免疫療法將一種小分子肽作用于ACPA陽性患者，可減少關(guān)節(jié)內(nèi)部肽精氨酸脫亞氨酶（peptidyl arginine-deiminase，PAD）或瓜氨酸化蛋白釋放［49］。這種小分子肽與瓜氨酸化抗原競爭結(jié)合B細胞受體，從而抑制B細胞受體交聯(lián)；構(gòu)建的自身抗原四聚體肽可將瓜氨酸化肽和補體激活裂解肽偶聯(lián)在一起，特異性清除RA患者自身反應(yīng)性B細胞，阻止疾病發(fā)生。此外，臨床試驗顯示利用瓜氨酸化肽修飾的自體耐受性樹突狀細胞（autologous tolerogenic dendritic cells，tolDCs）進行治療安全性較高且具有良好耐受性，能夠發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。RA患者外周血單核細胞經(jīng)IL-4、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）和核因子-κB（NF-κB）抑制劑作用48 h后體外分化出tolDCs。瓜氨酸化肽修飾處理tolDCs 3 h，對攜帶HLA-DR共享表位的RA患者進行皮內(nèi)注射，持續(xù)給藥治療1個月后，效應(yīng)T細胞顯著減少，同時降低了促炎細胞因子和趨化因子表達，減少了炎癥反應(yīng)［42］。類似于“抗原佐劑”模型，在AD中抗原和免疫調(diào)節(jié)劑組合可能將免疫應(yīng)答導(dǎo)向為對自身抗原的耐受性。研究表明水稻種子中也表達了RA自身抗原，將轉(zhuǎn)基因水稻種子作為疫苗在小鼠模型中口服飼喂，臨床評分降低，骨侵蝕及炎癥均有減輕［50］。可見與非特異性療法相比，采用自身抗原特異性免疫治療的毒性和危險性比免疫抑制低得多，且可對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生更有針對性的反應(yīng)。

圖1 自身抗原參與的RA免疫應(yīng)答［35］Fig.1 RA immune response with autoantigen［35］

4 總結(jié)與展望

AD發(fā)病機制復(fù)雜，當人體免疫耐受遭到破壞導(dǎo)致自身反應(yīng)性T細胞/B細胞異常活化時，自身抗體大量產(chǎn)生導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和組織損傷。自身抗原是機體免疫過程中的作用靶點，利用抗原特異性小肽治療可有效競爭結(jié)合淋巴細胞，降低促炎細胞因子表達，減少自身抗原釋放從而抑制自身抗體介導(dǎo)的組織損傷。同時，也可利用自身抗原生產(chǎn)疫苗促進機體產(chǎn)生抗性，預(yù)防疾病發(fā)生。與傳統(tǒng)治療方法相比，抗原特異性免疫治療對機體損傷更小，效果更明顯。因此，針對自身抗原的探究和醫(yī)療手段有望為AD預(yù)防、診療提供新的策略。