microRNA在自身免疫性肝炎中的作用機制研究進展①

趙海霞 雒 揚 李 汛 （蘭州大學第一臨床醫學院，蘭州 730000）

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一種以轉氨酶水平升高、血清自身抗體陽性、高IgG血癥、界面性肝炎和肝組織漿細胞浸潤為特征的自身免疫介導的慢性肝臟內生組織炎癥反應［1］。盡管人們已對環境、遺傳和表觀遺傳因素驅動的肝臟免疫穩態失調具有廣泛了解，但AIH發病的潛在分子機制尚未明確［1］。AIH缺乏特異性診斷指標，目前診斷是基于臨床表現、生化檢查、血清免疫學和組織學表現的綜合診斷［2］。糖皮質激素加硫唑嘌呤是AIH的標準治療方案，但僅對70%～80%患者有效，且常見藥物副作用及不良反應［1］。AIH未經及時診斷和有效治療可迅速發展為肝衰竭、肝硬化甚至肝癌［3-4］。因此，闡明AIH的發病機制、尋找AIH的特異性標志物及新型治療策略具有重要意義。

miRNA具有廣泛調控作用，可潛在調節細胞各方面生物功能，在多種自身免疫性疾病中起關鍵作用，miRNA失調通常影響疾病發生、發展和預后［5］。miRNA與炎癥相關通路的相互作用參與AIH發生發展，可作為AIH新的治療靶點，并進一步證實miRNA也可成為AIH的生物標志物。故本文將miRNA對AIH的調控作用及其在AIH診斷、治療方面的研究進展進行綜述。

1 miRNA概述

miRNA是動、植物和某些病毒中發現的一類短小非編碼RNA。1993年在秀麗隱桿線蟲中發現 了第一個miRNA lin-4，2000年發現了第一個人類miRNA let-7，目前miRNA數據庫中標注了2 000多種人類成熟miRNA［6］。miRNA是一種內源性、進化高度保守的單鏈RNA，其長度約為22個核苷酸，可通過與靶mRNA互補序列結合干擾蛋白產生［7］。除翻譯抑制外，miRNA還可吸引和招募mRNA限制因子，導致mRNA降解和基因表達中斷，從而在轉錄和轉錄后水平調控目的基因表達［8］。人體內1/3左右基因在不同程度均受到miRNA調控，每個miRNA可調控數個靶基因，而同一個靶基因也可被多個miRNA調控［9-10］。因此miRNA對靶基因表達的調控作用在人類基因組中構成了一個龐大而復雜的網絡系統，在各種生物過程中發揮重要作用。

2 miRNA生物合成

2.1 經典途徑 初級miRNA（primary miRNA，primiRNA）是一種具有5＇端m7GpppN帽子結構和 3＇端多聚腺苷酸尾并折疊形成莖環結構的長達幾百個堿基對的可變轉錄產物，在細胞核中由獨立基因或編碼蛋白質的DNA序列內含子經RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymerse Ⅱ，RNA polⅡ）轉錄后產生。轉錄產生的pri-miRNA在細胞核中通過與包含RNA內切酶Ⅲ Drosha及其輔助因子DGCR8組成的微處理器復合物相互作用，被修飾為長度60～200個核苷酸的前體miRNA（precursor miRNA，pre-miRNA），pre-miRNA通過GTP依賴的核質/細胞質轉運蛋白Exportin5（RanGTP/exportin-5）復合物將其從細胞核轉運至細胞質，在細胞質中再由另一種RNA內切酶ⅢDicer及其伴侶蛋白反式激活反應RNA結合蛋白（transactivation response RNA-binding protein，TRBP）將premiRNA末端的莖環結構剪切后產生長度約為22個核苷酸的miRNA雙鏈體［11-12］。miRNA雙鏈體中的引導鏈成為最終成熟的miRNA，參與RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）形成，該復合體是促進特定miRNA與靶向mRNA結合的關鍵因子，其隨從鏈因結構不穩定將被降解［13-14］。

2.2 非經典途徑 非經典途徑即miRNA生物合成的替代途徑，經替代途徑合成的幾種不同類別RNA在結構和功能上與miRNA相似，但繞過了miRNA經典生物合成途徑中的一個或多個步驟。經典途徑中，Drosha和DGCR8是miRNA合成是必不可少的。因此，不依賴于Drosha和DGCR8合成miRNA的途徑被認為是miRNA合成的非經典途徑。非經典途徑中，某些脫支內含子可被剪接體加工成套索狀“mirtrons”，被套索狀的脫支酶裂解，折疊為premiRNA發夾，隨后，這種pre-miRNA同樣通過RanGTP/exportin-5復合物轉運至細胞質，以經典途徑繼續進行miRNA合成［15］。miRNA的生物合成過程如圖1所示。

圖1 miRNA生物合成Fig.1 Biogenesis of miRNA

3 miRNA在AIH中的調控作用

3.1 miRNA對AIH患者肝臟Kupffer細胞（Kupffer cells，KCs）的調控作用 巨噬細胞在生理和病理狀態下對維持肝臟免疫穩態起主導作用，在信號分子作用下具有非?？焖俚谋硇秃凸δ茏兓芰Γ筛鶕闻K組織微環境需要活化為M1表型或M2表型。M1型巨噬細胞以分泌促炎因子和趨化因子為主，參與正向免疫應答，M2型則通過分泌抗炎因子負調控免疫應答，發揮組織修復功能［16］。KCs是具有自我更新能力的肝內常駐巨噬細胞，通過產生促炎因子、將抗原提呈給T細胞并與肝竇內皮細胞協同啟動竇內血栓形成參與AIH發?。?7-18］。

miRNA在不同炎癥反應中對巨噬細胞發育、活化等生物學過程具有重要調節作用［19］。YANG等［20］發現在刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）誘導的小鼠肝損傷早期，KCs中miR-223水平顯著降低，進一步發現miR-223通過負調控KCs中黑色素瘤缺失因子2（absent in melanoma 2，AIM2）表達減少促炎因子IL-1β分泌。其次，miR-223是骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）中表達最高的miRNA，尤其在BMSCs來源的外泌體中高表達，通過抑制炎癥小體NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor pyrin domain containing 3，NLRP3）活化抑制NLRP3/caspase-1信號通路激活，減少IL-1β成熟和分泌、誘導炎癥細胞焦亡，顯著逆轉小鼠AIH肝損傷［21］。表明miR-223通過調節KCs功能在AIH發病機制中起重要作用，且可能成為治療AIH的新靶點之一。

此外，ConA誘導的小鼠急性肝損傷過程中，KCs中miR-375高表達，與促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達呈正相關，而與星形細胞上調基因-1（astrocyte-elevated gene-1，AEG-1）表達呈負相關，功能研究證實miR-375抑制劑通過直接靶向調控AEG-1表達減少KCs凋亡，從而恢復肝臟免疫穩態［22］。同樣，另一項類似研究觀察到，KCs中miR-138表達上調且可通過靶向負調控P53基因表達增加促炎因子釋放，轉染miR-138抑制劑后小鼠肝功能得到明顯改善［23］。

3.2 miRNA對AIH患者T細胞的調控作用 CD4+T細胞活化介導AIH肝損傷已得到證實，Treg免疫調節受損和Th17細胞分化增加在AIH發生發展過程中起核心作用，Treg/Th17平衡與AIH疾病嚴重程度呈顯著正相關［24］。已發現多種miRNA通過調節Treg/Th17平衡參與AIH肝臟炎癥反應。

ZHAO等［25］通過構建miR-7基因敲除模型首次發現miR-7缺失加劇ConA誘導的小鼠免疫性肝損傷，miR-7缺失的AIH小鼠肝組織中促凋亡蛋白Bad、Bax和p53表達顯著增加、CD4+T細胞比例急劇上升，且miR-7通過靶向絲裂原活化蛋白激酶4 （mitogen-activated protein kinases 4， MAPK4）部分負調控CD4+T細胞活化和功能，而轉錄因子CCAAT/增強子結合蛋白α（CCAAT/enhancer binding protein-α， C/EBPα）可通過與miR-7b基因核心啟動子區結合調節CD4+T細胞miR-7表達，提示C/EBPα/miR-7軸在CD4+T細胞中對免疫性肝損傷發揮重要作用。

miR-15a/16-1是一種腫瘤抑制因子，但最近研究表明，其在生理和病理條件下均可作為免疫調節劑影響巨噬細胞吞噬作用、NK細胞成熟及T細胞活化［26］。AIH小鼠模型中，miR-15a/16-1表達下調，與IL-22表達呈負相關，敲除miR-15a/16-1后小鼠肝組織局部具有較高水平的IL-22分泌，且血清轉氨酶水平下降，肝臟炎癥浸潤減輕，表明miR-15a/16-1以IL-22依賴方式改善肝損傷，進一步研究顯示，CD4+T細胞是肝損傷期間IL-22的主要來源，而芳基烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AHR）是CD4+T細胞miR-15a/16-1的直接靶標，敲除CD4+T細胞的miR-15a/16-1通過上調AHR表達產生更多的IL-22，而IL-22通過激活pSTAT3-c-myc信號通路進一步下調受損肝細胞中miR-15a/16-1表達，可見miR-15a/16-1類似“剎車分子”，通過調節CD4+T細胞IL-22分泌介導AIH肝損傷修復［27］。

ZHANG等［28］發現，miR-let-7a通過下調IL-6分泌負調節Th17細胞分化，對免疫性肝損傷具有顯著治療作用。IL-6是經典炎癥細胞因子，不僅可抑制TGF-β誘導的Treg分化，還通過誘導維甲酸相關孤核 受 體γt（retinoid-related orphan receptor gammat，RORγt）表達促進Th17細胞分化［29］。而let-7a通過負調節IL-6分泌抑制Th17細胞分化，因此miR-let-7a/IL-6信號通路可能成為AIH的另一潛在治療靶點。

miR-155是與免疫調控關系最為密切的miRNA之一，分布廣泛，且具有多靶基因特性，miR-155表達或功能異常參與多種肝臟疾病發生發展［30］。miR-155也是AIH發病的研究熱點之一。與野生型AIH小鼠相比，miR-155-/-AIH小鼠注射ConA后轉氨酶和促炎因子IFN-r、TNF-α水平明顯升高，肝臟炎癥及壞死嚴重程度提高，敲除miRNA-155基因通過直接靶向負調控SHIP1表達導致Treg數減少且在肝臟中募集受損，維持炎癥細胞中miR-155正常表達對AIH肝損傷具有保護作用［31］。但另外一項研究則得出相反結論，miR-155抑制劑通過減少炎癥細胞浸潤、恢復破壞的肝臟結構及調節Treg/Th17失衡顯著改善ConA誘導的急性肝損傷［32］。此外，還有研究報道，miR-155主要在AIH患者肝臟門脈區CD4+T細胞中高表達，可能通過調節Treg/Th1平衡參與AIH發?。?3］。可見miR-155的多靶基因特性使其在炎癥細胞募集和肝臟損傷過程中可能具有不同作用，原因可能為其介導的基因表達在AIH不同發病階段產生的效果不一。

另外一項評估攜帶miR-223的外泌體對AIH治療作用的研究發現，miR-223能夠調節AIH小鼠模型肝內IL-1β和IL-6表達、抑制Th17細胞分化、改變肝臟和脾臟中Treg和Th17細胞比例，抑制病情發展，提示外泌體由于其較弱的毒性、免疫原性和較低的不良反應，可作為外源性miRNA治療AIH的生物載體［34］。

3.3 miRNA對AIH脂質代謝和纖維化的調控作用 半胱氨酰白三烯（cysteinyl leukotrienes，CysLTs）是花生四烯酸（arachidonic acid，AA）的代謝產物，是一種普遍存在的炎癥遞質，參與調節AIH炎癥反應，可通過增加鈣內流引起毛細血管收縮或減少谷胱甘肽耗竭加重肝損傷。ConA誘導的肝損傷早期，AA代謝的關鍵酶5-脂氧化酶（5-lipoxygenase，5-LO）過表達，CysLTs釋放增加，進一步研究發現miR-674-5p對肝細胞AA/5-LO代謝途徑具有負調控作用，可減輕CysLTs介導的肝損傷［35］。

miR-143已被證明可調節平滑肌細胞的細胞外基質基因表達、抑制TGF-β依賴性細胞外基質積聚和平滑肌細胞纖維化。miR-143-3p可通過抑制TGF-β活化激酶1（transforming growth factor-beta-activated kinase 1，TAK1）磷酸化減輕肝臟炎癥反應和纖維化［36］。miR-193a/b-3p可抑制Ⅰ型膠原α1鏈（COL1A1）和α-SMA表達及TGF-β/Smad2/3信號通路激活，在小鼠體內將其過表達可減輕ConA誘導的肝損傷，且可抑制膠原沉積、降低結蛋白和增殖細胞核抗原（PCNA）表達、降低肝組織中羥脯氨酸、TGF-β1和活化素A含量，對AIH肝纖維化起抑制作用［37］。多項研究證實miRNA在肝纖維化發生發展過程中具有重要調節作用，但目前針對AIH肝纖維化相關miRNA的研究較少，以上研究為miRNA參與調節AIH相關肝纖維化提供了有力支持。miRNA在AIH中的調控作用如圖2所示。miRNA在AIH中的作用機制見表1。

表1 miRNA在AIH中的作用機制Tab.1 Mechanism of miRNA in AIH

圖2 miRNA在AIH中的調控作用Fig.2 Regulatory role of miRNA in AIH

4 miRNA是AIH潛在的生物標志物

2015年MIGITA等［38］首次篩選出了46位1型AIH患者血清中差異表達的miRNA，并將其與慢性丙型肝炎患者和健康人群進行了比較，結果發現AIH患者循環中miR-21水平顯著高于慢性丙肝患者和正常人，且血清miR-21和miR-122水平與血清ALT水平呈正相關，miR-21也與AIH肝臟炎癥組織學分級相關，糖皮質激素治療后miR-21和miR-122水平大大降低，初步證明miR-21和miR-122可作為AIH疾病嚴重程度和治療反應的生物標志物。最近一項研究發現，與健康人群相比，AIH患者肝臟中miR-155表達上調，但在外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中表達下調［31］。KATSUSHIMA等［39］研究表明，與健康人群相比，AIH患者PBMCs中miR-132和miR-99a表達顯著升高，而miR-299-5p表達下降。崔海霞等［40］發現AIH患兒PBMCs中miR-181c表達下調。提示miRNA可作為AIH的診斷指標。miR-122是一種腫瘤抑制因子，可調節肝臟膽固醇和脂肪酸代謝及鐵穩態，在多種肝臟疾病中循環miR-122水平升高，或許可作為慢性丙型肝炎的生物標志物，且敏感性和特異性較高［41］。而miR-21由淋巴細胞表達，一方面可通過下調TNF-α誘導蛋白8樣因子2 （tumor necrosis factor-α induced protein-8-like-2，TIPE2）產生促進Fas誘導的細胞凋亡，另一方面可阻礙程序性細胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）蛋白產生，PDCD4可激活NF-κB，抑制抗炎因子IL-10分泌，因此miR-21可能調節PDCD4在AIH中的促炎效應和促凋亡活性，也可成為AIH的另一潛在干預靶點［42］。

miRNA能否作為AIH治療生物標志物主要取決于其器官特異性和致病性。肝臟特異性miRNA作為AIH的生物標志物是有效的，可作為預測常規免疫抑制治療無反應、停藥后復發或進展為肝硬化的指標進一步評估AIM。miR-122具有肝臟特異性，但其生物學意義尚未確定，miR-21與AIH的生物學相關性也有不同結果，停留在推測階段［42］。

5 潛在的AIH相關miRNA

國外學者采用微陣列技術分析了4例初治AIH患者和4例健康人肝臟活檢標本中miRNA和mRNA的差異表達譜，結果顯示，AIH患者肝組織中15個miRNA表達上調，8個miRNA表達下調（表2），進一步分析發現大部分差異表達基因為免疫應答相關基因，如Th1細胞應答相關基因CXCL9/10/11、CXCR3、IFN-γ、T-bet，Treg應 答 相 關 基 因CTLA4、FOXP3、PD-1、BTLA等［33］。此外，幾項研究通過分析不同AIH小鼠模型和健康小鼠肝組織miRNA表達，篩選出數個差異表達miRNA（表2），進一步生物信息學分析結果表明，多個差異表達miRNA可潛在調節包括Wnt信號通路、Hippo信號通路、鐵死亡、MAPK信號通路和內吞作用在內的數條信號轉導通路，這些信號通路均可能參與AIH疾病進展［43-45］。如內吞作用被定義為從細胞表面去除配體、營養物質、質膜蛋白及脂類成分，并將其帶入細胞內的一種機制，在維持免疫平衡方面至關重要，但內吞作用在AIH發生發展中是否不可或缺目前暫無報道。研究顯示，miR-7005-5p可能通過內吞作用和MAPK信號通路參與AIH發病，可能在“轉錄調控、DNA模板”等生物過程中具有更多功能，而miR-10a則在調節肝臟炎癥反應相關IFN和NF-κB信號通路中具有巨大潛力［43，45］。

表2 AIH相關miRNA表達Tab.2 Expression of AIH-related miRNA

6 總結與展望

自從發現第一個miRNA以來，miRNA在自身免疫性疾病中的差異表達及其生物學機制一直是研究熱點。得益于高通量技術和生物信息學發展，許多先前未知的AIH相關miRNA已被鑒定，miRNA可能是AIH疾病嚴重程度和治療反應的生物標志物，異常的miRNA譜可通過促炎因子產生和刺激自身免疫應答觸發AIH，miRNA在AIH中的作用機制研究有助于探索AIH新的治療靶點。但關于miRNA在AIH發病中的研究仍比較局限，研究樣本來源不同、miRNA測序技術及生物信息分析方法不一致及臨床相關混雜因素的影響可能是導致目前部分研究結果矛盾的原因之一。今后對AIH相關miRNA 的研究應考慮不同方法及疾病特征對研究結果的影響，采用質量有保證的樣本、規范研究技術和分析方法將有助于揭示AIH的病因和發病機制，并成為新的治療策略或生物標志物。