堿液預處理對檸條錦雞兒莖理化結構及酶解的影響

劉 寅，錢倩倩，2，苗彩云，李冠華，2，王玉芬

（1.內蒙古大學 生命科學學院 牧草與特色作物生物技術教育部重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010070；2.內蒙古大學 生命科學學院 省部共建草原家畜生殖調控與繁育國家重點實驗室，內蒙古 呼和浩特010070）

0 引言

檸條錦雞兒（Caragana korshinskii）是豆科錦雞兒屬灌木，廣泛分布在中國西北干旱和半干旱地區，是荒漠草原防風固沙和改善環境的重要生態植物。隨著樹齡增長，檸條錦雞兒的導水能力下降，葉片光合效率降低，長勢變得衰弱。平茬能夠促進枝條萌蘗及新根生發，增強檸條錦雞兒對水分和營養的吸收，提高光合效率，是保證檸條錦雞兒復壯、長勢繁茂的重要手段[1]。我國的檸條錦雞兒資源十分豐富，檸條錦雞兒平茬產物的年產量預計超過400萬t，平茬產物資源化利用，能夠增加檸條錦雞兒的林區經濟效益，有助于實現檸條錦雞兒防風固沙產業的可持續發展[2]。

目前，檸條錦雞兒平茬產物多被用于制備顆粒飼料，但檸條錦雞兒的木質化程度較高，口感較差，這限制了其推廣使用。檸條錦雞兒也可用于直燃發電、制備板材等，但是，總體而言，相應的產業發展并不成熟[3]。纖維素是自然界最豐富的有機物，也是檸條錦雞兒的主要成分之一，通過酶促水解反應生成單糖，并進一步轉化為其它生物質及化學產品是實現纖維素高效利用的重要途徑。多樣的化學組分、致密的物理結構、復雜的纖維形態，以及這些因素間的相互作用會阻礙纖維素的酶促水解反應，學者們將這種頑抗性稱為抗降解屏障。預處理是破壞抗降解屏障，提高纖維素酶解糖化效率的有效手段。其中，堿液預處理具有操作簡便、介質污染小、設備要求低和投資成本少等優點，已被成功應用于木材、小麥秸稈和甜菜渣等生物 質[4]～[6]。

目前，有關堿液預處理檸條錦雞兒等灌木生物質的研究報道較少。因此，本文以我國西北地區重要的生態灌木檸條錦雞兒為研究對象，首先以粗蛋白含量和酶解還原糖得率為指標，比較了檸條錦雞兒葉和不同徑級莖的可消化性；然后以NH3·H2O，Ca（OH）2和NaOH3種 堿 溶 液 為 反 應 介質，預處理檸條錦雞兒莖，考察堿預處理對檸條錦雞兒莖的化學組分、化學基團、結晶度、孔隙率、孔徑分布和酶解還原糖得率的影響，以期闡明堿液預處理對檸條錦雞兒等灌木生物質抗降解屏障的破壞機制，并為檸條錦雞兒纖維素的高值轉化提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

檸條錦雞兒取自內蒙古自治區和林格爾縣，樣品于60℃烘干后，將葉與莖分離，并根據直徑大小將莖進一步分為細莖（直徑＜0.5cm）、中莖（直 徑 為0.5～1.0cm）和 粗 莖（直 徑＞1.0cm）。將 檸條錦雞兒葉和不同徑級莖分別粉碎后過40目篩，裝密封袋備用。纖維素酶（Trichoderma vride G）購于上海源葉生物科技有限公司，酶活為100U/g，溴化鉀（光譜純）購于Sigma-Aldrich公司，其他試劑（國產分析純）購于內蒙古昭程商貿有限公司。

1.2 預處理

去除檸條錦雞兒的葉和細莖，剩余部分粉碎后過40目篩，放入100mL的藍蓋瓶中進行預處理。依據相關的堿液預處理條件和前期實驗結果[7]，分 別 以 質 量 分 數 為10%的NH3·H2O，0.1%的Ca（OH）2（溶 解 度 僅 為1.65g/L）和1%的NaOH溶液為反應介質，固液比為1∶10，溫度為80℃，預處理時間為6h，反應結束后用蒸餾水沖洗樣品至中性，然后60℃烘干至恒重，未經預處理的樣品設為對照組。預處理過程的質量損失率WL的計算式為

式 中：mA，mB分 別 為 預 處 理 前、后 樣 品 的 質 量，g。

1.3 酶解還原糖得率的測定

向100mL的錐形瓶中依次加入1.5g樣品和30mL檸檬酸緩沖溶液（濃度為0.05mol/L，pH值為4.8），纖維素酶用量為20FPU/g，溫度為50℃，震蕩水浴48h。酶解反應結束后，離心，收集上清液，采用3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖濃度。酶解還原糖得率RSY的計算式為

式中：ρ為酶促水解反應生成的還原糖濃度，mg/mL；V為 酶 解 液 體 積，mL；m為 樣 品 質 量，g。

1.4 化學組分的測定

采用Van Soest法（稍作改進）測定樣品的化學組分。樣品的初始質量為m0，樣品依次經過中性洗滌劑、質量分數為7%的鹽酸和72%的硫酸處理，每一步處理后，過濾殘渣依次用水和丙酮洗滌，然后烘干稱重，殘渣質量依次記為m1，m2和m3。中性洗滌物含量（NDS）、半纖維素含量（HCel）、纖 維 素 含 量（Cel）和 木 質 素 含 量（Lig）的 計 算式分別為

1.5 粗蛋白含量的測定

采用凱氏定氮法測定樣品的粗蛋白含量。樣品首先于KDN-08A型石墨消化爐中消煮1h，然后采用SKD-3000型全自動凱氏定氮儀測定樣品的含氮量。粗蛋白含量CP的計算式為

式中：N為氮含量，mg/g；6.25為氮含量換算為粗蛋白質含量的平均系數。

1.6 傅里葉紅外光譜的測定

采用IR-Affinity-1S型傅里葉紅外光譜儀測定樣品的紅外吸收光譜。樣品粉碎后過200目篩，稱取1mg樣品與99mg KBr，混合后充分研磨，在150MPa下壓制10min，形成KBr錠片。掃描波長為400～4000cm-1，掃描次數為40次，分辨率為8 cm-1。

1.7 結晶度的測定

采用X'Pert PRO型X射線衍射儀測定樣品的結晶度。測試條件：電壓為40kV，電流為40 mA，步 長 為0.02°，掃 描 角 度2θ為5～40°。結 晶 度指數CrI的計算式為

式中：Icr為 纖維素中2θ為22～23°處的 結晶區強度峰值；Iamor為纖維素中2θ為18～19°處的非晶區強度最小值。

1.8 孔徑分布和孔隙率的測定

采用AutoPoreⅣ9500型壓汞儀測定樣品的孔徑分布和孔隙率，測試溫度為26℃，壓力為0.00345～227.53MPa。

2 結果與分析

2.1 檸條錦雞兒可消化性分析

檸條錦雞兒是一類具有重要生態價值的飼用灌木，可消化性是表征植物飼用品質的重要指標，本研究從粗蛋白含量和酶解還原糖得率2個方面，比較了檸條錦雞兒莖和葉的可消化性。檸條錦雞兒不同部位的可消化性如圖1所示。從圖1可以看出，檸條錦雞兒葉的可消化性高于莖，葉的粗蛋白含量和酶解還原糖得率分別為222.68mg/g和178.61mg/g。植物的不同器官發揮著不同的生物學功能，其組織結構上存在巨大差異，莖主要由起支撐和傳輸作用的維管組織構成，而葉主要由薄壁組織構成。Costa T H F的研究表明，植物的頑抗性因細胞類型而異，維管組織擁有比薄壁組織更強的抗降解性[8]。此外，葉是植物的光合器官，葉中與光合作用相關的蛋白質較為豐富。因此，檸條錦雞兒葉的可消化性高于莖。

圖1 檸條錦雞兒不同部位的可消化性Fig.1 Digestibility of different parts of Caragana korshinskii

從圖1還可以看出：檸條錦雞兒不同徑級的莖可消化性不同，其中細莖的可消化性最好，其酶解還原糖得率和粗蛋白含量分別為127.55mg/g和129.12mg/g；中莖和粗莖的可消化性較差，且無顯著性差異。在植物生長過程中，隨著木質素的積累，組織木質化程度增加，導致可消化性降低。因此，檸條錦雞兒的飼用品質與莖的直徑呈負相關[9]。檸條錦雞兒葉和細莖的可消化性較好，能夠直接用作飼料；而中莖和粗莖的可消化性較差，不宜直接作為飼料，但這一部分是檸條錦雞兒生物量的主體。在實現葉、莖分級的基礎上，提高中莖和粗莖的轉化效率，是對檸條錦雞兒資源化利用的關鍵。

2.2 堿液預處理對檸條錦雞兒莖化學結構的影響

2.2.1 檸條錦雞兒莖顏色和化學組成的變化

堿液預處理前后，檸條錦雞兒莖顏色和化學組分的變化情況如圖2所示。從圖2（a）可以看出，堿液預處理后，樣品的顏色由淡黃色變為褐色，這是由非結構組分的降解以及木質素的溶出與活化引起的[10]。其中，NH3·H2O和NaOH預處理引起的顏色變化更為明顯；Ca（OH）2預處理引起的顏色變化較小，這是由于其堿性較弱。

圖2 堿液預處理前后，檸條錦雞兒莖顏色和化學組分的變化情況Fig.2 Changes of color and chemical component of stem from Caragana korshinskii before and after alkali pretreatment

從 圖2（b）可 以 看 出：樣 品 經NH3·H2O，Ca（OH）2和NaOH預處理后，質量損失率分別為16.95%，8.04%和22.25%；堿液預處理后，樣品中的中性洗滌物含量顯著降低。這是因為中性洗滌物主要是細胞內的可溶性物質，主要成分為蛋白質、脂類、灰分、單寧等，堿液處理可以破壞細胞結構，溶出其中的可溶性物質。半纖維素是具有支鏈的無定形多糖，經過NH3·H2O和NaOH預處理后，其含量顯著減少，表明堿液預處理能去除半纖維素；半纖維素的去除使得半纖維素與木質素間的交聯作用減弱。堿液預處理后，木質素含量的變化不顯著，木質素的去除效率受到反應條件和樣品種類的影響，通常而言，堿液預處理對木質素含量高的植物的作用效果較差[11]。經Ca（OH）2預處理后，樣品中的半纖維素和木質素含量率略有增加，這是由于該堿液的堿性較弱，對半纖維素和木質素的去除能力較差，隨著中性洗滌物的減少，半纖維素和木質素的含量相對增加。纖維素是一種高聚合度和高分子量的多糖化合物，分子間氫鍵使纖維素絲束排列緊密有序，在堿性條件下也具較高的穩定性[12]。隨著其他化學組分的去除，纖維素的相對含量增加，更多的纖維素有助于產生更多的葡萄糖。

2.2.2 檸條錦雞兒莖化學基團的變化

紅外光譜是分析樣品化學基團變化的常用手段。堿液預處理前后，檸條錦雞兒莖的紅外光譜如圖3所示。從圖3可以看出：1735cm-1附近的吸收峰減弱或消失，表明半纖維素側鏈乙?；黄茐?，木質素和半纖維素間的酯鍵被斷裂；1235cm-1和831cm-1附近的吸收峰減弱，表明木質素間的醚鍵被破壞，紫丁香基被去除；1161cm-1和900 cm-1附近的吸收峰增強，表明不對稱C-O-C橋和β-葡萄糖苷含量增加，纖維素含量提高，這和化學組分的變化結果相一致。紅外光譜表明，堿液預處理對木質素有一定去除效果但不顯著，然而堿液預處理能有效地去乙酰化，破壞木質素與半纖維素間的酯鍵以及木質素間的醚鍵，進而破壞木質素與半纖維素形成的交聯結構，這種交聯結構的破壞有助于提高檸條錦雞兒莖的酶解還原糖得率[13]。

圖3 堿液預處理前后，檸條錦雞兒莖的紅外光譜圖Fig.3 FTIR of stem from Caragana korshinskii before and after alkali pretreatment

2.3 堿液預處理對檸條錦雞兒莖物理結構的影響

堿液預處理前后，檸條錦雞兒莖的結晶度指數和孔隙率的變化見表1。由表1可知：對照組樣品 的 結 晶 度 指 數 為25.64%，經 過NH3·H2O，Ca（OH）2和NaOH預處理后，樣品的結晶度指數均提高，分別達到39.73%，31.87%和45.64%；對照組樣品的孔 隙 率 為72.32%，經NH3·H2O，Ca（OH）2和NaOH預處理后，樣品的孔隙率分別提高至77.71%，78.78%和78.70%。堿液預處理可以破壞纖維素的結晶區，降低纖維素結晶度；但就木質纖維素而言，非結晶區不僅包括纖維素的無定形區，還包括中性洗滌物和半纖維素等無定形成分，結晶度的提高可能是由于中性洗滌物和半纖維素等非結晶組分的降解造成的，結晶度升高預示著結晶纖維素 的 暴 露[14]。

表1 堿液預處理前后，檸條錦雞兒莖的結晶度指數和孔隙率Table1 CrI and porosity of stem from Caragana korshinskii before and after alkali pretreatment

堿液預處理前后，檸條錦雞兒莖的孔徑分布如圖4所示。從圖4可以看出，對照組樣品的最可幾 孔 徑 為8055.51nm，經 過NH3·H2O，Ca（OH）2和NaOH預處理后，樣品的最可幾孔徑分別增大至13964.78，11326.39nm和21368.87nm。這表明堿液預處理能夠破壞樣品的致密結構，在樣品預處理過程中，隨著半纖維素和部分木質素等組分的降解，細胞壁結構被破壞，使樣品的孔隙和孔徑增多增大，這將有利于纖維素酶進入檸條錦雞兒莖的孔隙內部。

圖4 堿液預處理前后，檸條錦雞兒莖的孔徑分布Fig.4 Pore size distribution of stem from Caragana korshinskii before and after alkali pretreatment

2.4 堿液預處理對檸條錦雞兒莖酶解還原糖得率的影響

堿液預處理前后，檸條錦雞兒莖的酶解還原糖得率如圖5所示。從圖5可以看出，對照組樣品的酶解還原糖得率僅為91.51mg/g，經NH3·H2O，Ca（OH）2和NaOH預處理后，檸條錦雞兒莖的酶解還原糖得率均顯著提高，分別達到152.57，108.08，176.72mg/g，分 別 提 升 了66.68%，17.91%，93.12%。木質纖維素生物質具有多樣的化學成分和多層次的分子結構，木質素和半纖維素通過化學鍵交聯形成的復雜致密網絡結構，纖維素分子鏈之間由氫鍵有序連接形成致密的結晶區等，阻礙了酶與底物的接觸和作用，進而影響纖維素酶解效率。有研究認為，相比于木質素的含量，木質素與多糖間的交聯才是影響纖維素酶解效率的關 鍵 因 素[15]。

圖5 堿液預處理前后，檸條錦雞兒莖的酶解還原糖得率Fig.5 RSY of stem from Caragana korshinskii before and after alkali pretreatment

本研究利用較溫和的堿液預處理檸條錦雞兒莖，降解了半纖維素，有效斷裂了木質素與半纖維素之間的化學鍵，進而破壞了木質素與半纖維素間的網狀交聯，暴露出纖維素結晶區，增強了纖維素可及性，最終表現為更高的酶解還原糖得率。此前研究中，堿液預處理通常需要較嚴苛的條件，如高濃度堿液、高溫（＞100℃）或高壓，以實現木質素的溶出，從而提高生物質酶解效率[11]。本文研究結果表明，使用堿液在相對溫和的條件下預處理檸條錦雞兒莖，通過破壞關鍵化學交聯鍵，改變木質纖維素結構，同樣能夠達到較好的預處理效果，這為檸條錦雞兒等灌木生物質預處理工藝的建立提供了新的思路。

3 結論

①檸條錦雞兒是一種具有較高開發利用價值的荒漠生態植物，根據不同部位的理化結構差異對其進行分級利用，是實現其高值化利用的有效手段。

②堿液預處理可以去除檸條錦雞兒莖中的半纖維素乙酰基、降解半纖維，斷裂半纖維素與木質素間的酯鍵和木質素間的醚鍵，提高纖維素含量，還可以破壞檸條錦雞兒莖的致密結構，暴露纖維素結晶區，進而顯著提高其酶解還原糖得率。

③溫和的堿液預處理是檸條錦雞兒等灌木生物質的理想預處理手段。