大導管型及小導管型肝內膽管癌的臨床病理特征及預后分析

姚 平，阮 萍，劉 瑩，鄭 玲，林國彪

(1.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院病理科，廣西 南寧 530011；2.廣西中醫藥大學藥學院藥理學教研室，廣西 南寧 530200)

膽管癌(cholangiocarcinoma，CCA)是一種起源于膽管上皮的惡性腫瘤，根據其解剖位置，CCA可分為肝內膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICCA)、肝門周膽管癌(perihilar cholangiocarcinoma，PCCA)和遠端CCA(distal cholangiocarcinoma，DCCA)。其中ICCA發病率占胃腸道系統所有惡性腫瘤的3%，已成為僅次于肝細胞性肝癌的第二大肝臟惡性腫瘤，占原發性肝癌發病率的10%～20%[1]。 2019年第5版《WHO消化系統腫瘤分類》將ICCA分為大導管型及小導管型[2]。目前國內尚無開展關于兩種亞型ICCA的大樣本臨床研究，故本研究就此進行相關分析。報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2012年1月-2020年12月在廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院接受手術治療后并隨訪的ICCA患者91例。納入標準：①手術方式為根治性手術及區域淋巴結清掃；②術后石蠟病理證實為ICCA；③有完整隨訪資料；④術前影像檢查證實無遠處器官轉移。排除標準：①存在射頻消融、放療、化療史者；②混合型肝癌；③合并其他惡性腫瘤；④圍手術期死亡病例；⑤隨訪中發生非腫瘤相關死亡。收集患者的性別、年齡、肝病史、腫瘤大小、腫瘤發病部位、病理學分級、AJCC第八版臨床分級、有無淋巴結轉移、有無血管及神經侵犯、周邊肝組織病變等數據。通過電話和門診復診方式隨訪，所有病例每3個月定期隨訪1次。無瘤生存時間定義為手術日期至第1次臨床確診腫瘤的復發日期或末次隨訪日期。總生存時間定義為手術日期至死亡日期。隨訪截止日期為2021年1月，隨訪期限內隨訪結束日期為患者死亡日期。

本研究經廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院倫理審查委員會批準通過。所有患者或其法定監護人均知情同意并簽署知情同意書。

1.2診斷標準 病理診斷和形態學分類采用蘇木精-伊紅染色、輔以免疫組織化學及AB-PAS染色綜合分析。病理切片由2位病理醫師復閱，參照2019年第5版《WHO消化系統腫瘤分類》[2]，并結合Hayashi等[3]的標準將腫瘤進行評估分型(表1)，大導管型指標數量>小導管型指標數量診斷為大導管型，反之為小導管型，其余診斷為不確定型。結論不一致者由第3名醫師進行評估，最后討論達成共識。

表1 結合黏液蛋白和免疫表型的ICCA分類評分表 Table 1 ICCA classification score table combining mucin and immunophenotype

1.3特殊染色及免疫組織化學染色 所有標本均充分取材，經10%中性福爾馬林固定，常規脫水，石蠟包埋，組織切片3～4 μm厚，HE染色。特殊染色采用AB-PAS法對黏液蛋白進行評估。染色后，光鏡下觀察黏液蛋白呈藍色。采用半定量評價：評分0分，腺腔內黏液蛋白積聚<10%；評分1分，腺腔黏液蛋白積聚10%～50%；評分2分，腺腔內黏液蛋白積聚>50%或胞漿內黏液蛋白豐富。

免疫組織化學染色用LUMATAS自動免疫組織化學染色機(美國，Lumatas BioSystems Inc)進行。切片用下列抗體染色：福州邁新公司鼠抗人S100P單克隆抗體( 編號MAB-06997， 工作濃度1∶200)，鼠抗人N-cadherin單克隆抗體( 編號MAB-0571， 工作濃度1∶300)。二抗、顯色系統、脫蠟液、緩沖液、抗原修復液和抗體稀釋開放試劑瓶均由全自動染色儀配套提供。S100P主要染色部位為細胞核/細胞質，N-cadherin主要染色部位為細胞膜/細胞質。對這些抗體的免疫反應性半定量評估如下：得分0，<1%陽性細胞；1分，1%～25%陽性細胞；2分，26%～50%陽性細胞；3分，51%～75%陽性細胞；4分，76%～100%陽性細胞[3]。

1.4統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件分析數據。計數資料比較采用χ2檢驗，等級資料比較采用秩和檢驗。采用Kaplan-Meier生存分析法做無復發生存曲線及總生存曲線分析，Log-rank法比較組間生存率。采用Cox比例回歸風險模型分析大導管型肝內膽管癌患者預后的影響因素。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1病理形態學改變 91例ICCA患者隨訪時間為0.70～76.50個月。根據黏蛋白狀態、S100-P及N-cadherin對ICCA進行組織學分類，其中大導管型52例(57.14%)，小導管型32例(35.16%)，未確定型7例(7.69%)。各種類型的ICCA均可見管狀、腺泡狀、篩狀、實體狀等組織結構。大導管型ICCA的腫瘤細胞多呈高柱狀，形成大的腺管樣結構(圖1A)，細胞胞漿及腺腔內多可見黏液(圖1B)。免疫組織化學S-100P染色常為陽性(圖1C)。間質纖維化明顯，常可見神經侵犯，癌周膽管上皮內瘤變易見。小導管型ICCA的腫瘤細胞體積較小，多呈矮柱狀或立方狀，形成腺泡或小管狀結構(圖1D)，細胞胞漿及腺腔內黏液稀少(圖1E)，免疫組織化學N-cadherin染色多為陽性(圖1F)。

圖1 大、小導管型ICCA的病理組織學特點A.大導管型ICCA大腺管結構明顯，細胞呈高柱狀，可見細胞內黏液(箭頭示)(HE ×200)；B.大導管型ICCA可見胞漿內及腺腔內黏液(*示)(AB-PAS ×200)；C.大導管型ICCA S-100P陽性表達(IHC ×200)；D.小導管型ICCA呈小管狀結構，細胞呈立方狀(箭頭示)(HE ×200)；E.小導管型ICCA黏液蛋白缺失(AB-PAS ×200)F.小導管型ICCA N -cadherin陽性表達(IHC ×200)Figure 1 Pathohistopathological characteristics of large-duct subtype and small-duct subtype ICCA

2.2臨床病理特征比較 大導管型及小導管型ICCA患者淋巴結轉移、血管侵犯、CA199水平、TNM分期及肝內膽管結石病史等臨床病理特征差異有統計學意義(P<0.05)。2組性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤分化、肝內寄生蟲感染史、乙型肝炎感染等臨床病理特征差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 2種類型ICCA患者臨床病理特征比較 Table 2 Comparison of clinicopathological features between two types of ICCA (例數，%)

2.3生存分析 截至隨訪日期，大導管ICCA組存活5例(5/52，9.62%)，死亡47例(47/52，90.38%)，中位總生存時間11.20個月(0.70～61.00個月)，中位無復發生存時間20.30個月(0.70～49.60個月)；小導管ICCA組存活6例(6/32，18.75%)，死亡26例(26/52，81.25%)，中位總生存時間30.80個月(5.33～76.50個月)，中位無復發生存時間41.37個月(18.43～66.00個月)。大導管ICCA組術后1、3、5年總生存率(分別是48.08%、13.46%、1.92%)明顯低于小導管ICCA組(分別是78.13%、32.33%、6.25%；P<0.05)，大導管ICCA組術后1、3、5年的無復發生存率(分別是9.61%、5.77%、0.00%)與小導管ICCA組(分別是28.13%、18.75%、3.13%)差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 大、小導管型ICCA患者的總生存期和無復發生存期的Kaplan-Meier曲線圖A.總生存期;B.無復發生存期Figure 2 Kaplan-Meier curve of o-verall survival and recurrence-free survival of patients with large duct type and small duct type ICCA

2.4預后分析 以預后為因變量，以腫瘤大小、血管侵犯、淋巴結轉移、TNM分期、腫瘤分化及肝內膽石病史為自變量，變量賦值見表3，進行多因素Cox模型分析。結果顯示，淋巴結轉移、TNM分期是大導管型ICCA患者總生存期的預后不良因素，血管侵犯、TNM分期是無復發生存期的預后不良因素，見表4，5。

表3 預后情況多因素Cox分析變量賦值表Table 3 Variable assignment table of multivariate Cox analysis of prognostic factors

表4 大導管型ICCA患者生存的多因素分析Table 4 Multivariate analysis of survival in patients with large duct type ICCA

表5 大導管型ICCA患者復發的多因素分析Table 5 Multivariate analysis of recurrence in patients with large duct type ICCA

3 討 論

在過去10年間，ICCA的發病率增加近20%[4]。ICCA發病隱匿，惡性程度高，晚期5 年生存率為 5%～15%[5]。手術治療是首選方案，但術后復發率高達60%～70%[6]，且ICCA高度促結締組織增生的能力、多樣的腫瘤微環境及高度的異質性決定了其易對化療藥物產生耐藥性[7]。在最新的第5版WHO分類中，根據組織形態特點，ICCA可分為大導管型及小導管型[8]。小導管型ICCA可能來源于小葉間膽管和間隔膽管，腫瘤細胞起源為小的肝內膽管、前體細胞及成熟的肝細胞，表現為小的管狀或腺泡狀腺癌，沒有或很少產生黏蛋白。大導管型ICCA多起源于段、葉等較大膽管或伴發的膽周腺，是由產生黏液的柱狀細胞排列成大腺管或乳頭狀結構構成[9-11]。基于這兩種類型之間的生物學差異，對ICCA進行亞型分類已成為ICCA病理組織學診斷的重要組成部分，并與臨床的治療及預后評估密切相關。

本研究通過單中心樣本對大導管型、小導管型ICCA的臨床特征及生存期進行比較，并對大導管型ICCA進行生存分析，比較不同臨床特征與預后之間的關系。結合HE組織形態、免疫組織化學標記及黏蛋白等綜合分析，91例ICCA中，大導管型ICCA 52例，小導管型ICCA 32例，未確定型7例。小導管型ICCA患者的5年總生存率均高于大導管型患者，與Hayashi等[3]，Chung等[12]及Liau等[13]的研究結果一致。而Sigel等[14]研究提示，大導管型及小導管型ICCA患者的疾病特異性生存率及無復發生存率差異無統計學意義，這可能與該研究中大導管型ICCA患者例數過少(14例，8%)有關。

大導管型、小導管型ICCA表現出不同的臨床病理特征。在腫瘤的肝臟背景病變中，大導管型ICCA往往與肝內膽管結石和膽管上皮內瘤變相關[12]，本研究中大導管型ICCA的肝內導管結石發生率明顯高于小導管型。這可能是由于肝內膽管結石機械性刺激和膽汁淤積損傷膽管上皮細胞，改變了膽管組織周圍的微環境，從而導致膽管上皮再生、不典型增生、上皮內瘤變，最終導致膽管上皮癌變[15]。本研究對臨床特征進行單因素分析發現，肝內導管結石是大導管型ICCA的預后不良因素，這與葉冠雄等[16]研究結果一致。ICCA的轉移方式不同于肝細胞癌的經門靜脈血運轉移為主，而是以淋巴回流的形式向腹腔淋巴結轉移及肝外臟器的直接浸潤的方式進行[17]。第8版AJCC分期系統建議至少清掃6個淋巴結，以獲得準確的N分期[18]。淋巴結轉移對更準確地評估ICCA預后方面起著重要作用。許多研究都集中在淋巴結轉移數目和位置與預后的關系。然而，淋巴結清掃術是否能提高ICCA患者的存活率仍存在爭議。本研究結果顯示，與小導管型ICCA比較，大導管型ICCA的淋巴結轉移及血管侵犯發生率、血清CA199水平、TNM分期等明顯升高，這意味著大導管型ICCA比小導管型有更高的淋巴結轉移風險。淋巴結轉移是大導管型ICCA患者總生存期的預后不良因素，提示大導管型ICCA有必要進行系統性淋巴結清掃。而腫瘤標志物CA199的增高及TNM分期都說明，與小導管型ICCA比較，大導管型ICCA的預后較差。TNM分期是大導管型ICCA患者總生存期及無復發生存期的預后不良因素，這與以往的一些ICCA患者的預后研究相似[19-21]。

綜上所述，大導管型、小導管型ICCA患者的臨床病理特征有一定差異，大導管型ICCA的預后更差，淋巴結轉移、血管侵犯及TNM分期是其總生存期及無復發生存期的影響因素。由于病因和臨床轉歸不同，不同類型的ICCA對治療的反應也可能不同，對ICCA進行組織學亞型分類有一定的臨床意義。本研究的不足是小導管型ICCA病例數較少，后期仍需要擴大樣本數量并開展多中心研究以進一步驗證。