數(shù)字PCR技術(shù)檢測肺腺癌循環(huán)腫瘤DNA中EGFR突變的臨床意義

湯 濤，陳 曦，陳銅兵，王 輝

(江蘇省常州市第一人民醫(yī)院病理科，江蘇 常州 213003)

肺癌作為全球范圍內(nèi)的最常見的病死率最高的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計，全球每年新發(fā)肺癌患者約120萬例。2015年流行病學(xué)顯示，中國肺癌發(fā)病例數(shù)高達73萬例，死亡例數(shù)高達61萬[1]。近年來，隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的提出和發(fā)展，靶向治療，免疫治療及放化療已經(jīng)成為癌癥治療的重要手段，其中以表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)為靶點的人表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)為EGFR基因敏感突變的非小細胞肺癌患者帶來巨大的臨床獲益[2]。循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是由腫瘤細胞釋放到循環(huán)血液中的DNA。研究表明，患者ctDNA所攜帶的腫瘤突變信息與腫瘤組織具有良好的一致性，ctDNA已經(jīng)成為腫瘤特異性敏感標(biāo)志物[3]。ctDNA在腫瘤輔助診斷和預(yù)后檢測都具有很好的作用。近年來，隨著聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)的發(fā)展，數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR)技術(shù)已被用于非小細胞肺癌患者ctDNA中EGFR突變的檢測。然而，對ddPCR的臨床應(yīng)用以及臨床意義的研究有限。因此，本研究旨在明確ddPCR技術(shù)在ctDNA中檢測EGFR的臨床意義。報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2016年1月—2017年12月在蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院胸外科及呼吸科住院治療的肺腺癌的血液樣本，男性54例，女性48例，年齡32～83歲，平均(63.0±1.2)歲；有吸煙史65例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理診斷為肺腺癌；②組織學(xué)樣本已經(jīng)確定EGFR基因突變狀態(tài)；③采血前患者未接受過任何治療；④CT評估原發(fā)病灶大小。用ddPCR對血樣樣本行EGFR基因21號外顯子L858R(EGFR-L858R)和19外顯子缺失(EGFR-19del)突變檢測，引物序列如下：19ex-Fi：5′-GTGACGTAC-TAGCAACGTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCT-3′；19ex-Ri：5′-TAGCAGGATACGACTATCACA-CAGCAAAGCAGAAATCTAC-3′；21ex-Fi：5′-GTGACGTACTAGCAACGACAGCAGGGTCTT-CTCTGTTTC-3′；21ex-Ri：5′-TAGCAGGATACG-ACTATCTGACCTAAAGCCACCTCCTTAC-3′。

1.2血漿收集和DNA提取 Streck管收集患者血液，2 h內(nèi)3 000 r/min離心10 min，重復(fù)離心1次，分離上清，-80 ℃保存。ctDNA提取采用QIAamp DNA Blood Mini kitDNA提取試劑盒，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.3ddPCR ddPCR嚴(yán)格按照儀器操作手冊(Bio-Rad,CA,USA)進行。在檢測EGFR-L858R和EGFR-19del時。首先使用QX100液滴發(fā)生器(Bio-Rad)形成液滴。然后使用熱循環(huán)器(Bio-Rad)對每個液滴進行PCR擴增。PCR后，液滴在QX200液滴讀取器(Bio-Rad)上逐條分流，通過熒光計數(shù)來判斷目標(biāo)DNA濃度。使用QuantaSoft軟件(Bio-Rad)進行數(shù)據(jù)分析，一般要求滴數(shù)>8 000的數(shù)據(jù)才用于分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析。繪制受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve,ROC曲線)，分析ddPCR技術(shù)檢測ctDNA中EGFR突變的價值。采用Spearman相關(guān)分析檢驗兩個變量之間的相關(guān)性。使用Kaplan-Meier方法生成生存曲線。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1ddPCR技術(shù)預(yù)測患者真實的EGFR突變狀態(tài) 102例肺腺癌患者，T分期：T1 29例，T2 26例，T3 13例，T4 32例；N分期：N0 49例，N1 2例，N2 23例，N3 27例；M分期：M0 60例，M142例；病理分期：Ⅰ期患者32例，Ⅱ期8例(7.4%)，Ⅲ期18例，Ⅳ期44例；EGFR突變類型：EGFR基因野生型40例，EGFR-L858R突變型32例，EGFR-19del突變型26例，EGFR其他類型突變4例。繪制受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve,ROC)分析ddPCR技術(shù)檢測ctDNA中EGFR突變評價患者真實的EGFR突變狀態(tài)，結(jié)果顯示，在區(qū)分EGFR基因不同突變類型情況下，EGFR-19del曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.652(95%CI：0.557～0.774)(圖1A)，EGFR-L858R的AUC為0.646(95%CI：0.534～0.796)(圖1B)。ddPCR技術(shù)用于檢測ctDNA中EGFR-19del和EGFR-L858R突變的敏感度分別為41.5%和39.8%，特異度分別為91.0%和96.5%。此外，在不區(qū)分EGFR基因突變類型情況下，ddPCR技術(shù)檢測ctDNA中EGFR突變能否用于評價患者EGFR突變狀態(tài)，顯示AUC為0.694(95%CI：0.592～0.793)，敏感度為40.2%，特異度為88.6%(圖1C)。

圖1 ddPCR技術(shù)預(yù)測ctDNA中EGFR突變的ROC曲線A.EGFR-19del曲線Ⅰ～Ⅳ;B.EGFR-L858R曲線Ⅰ～Ⅳ;C.不區(qū)分EGFR突變類型Ⅰ～ⅣFigure 1 ROC curve of ddPCR in predicting EGFR mutation in ctDNA

2.2ctDNA預(yù)測晚期肺腺癌中具有較高的敏感度和特異度 Ⅰ～ⅢA定義為早期肺癌，ⅢB～Ⅳ定義為晚期肺癌。在早期肺癌患者中，ddPCR技術(shù)檢測ctDNA中EGFR突變，EGFR-19del的AUC為0.417(95%CI：0.431～0.537)，敏感度為0%，特異度為92.1%(圖2A)，EGFR-L858R的AUC為0.521(95%CI：0.383～0.636)，敏感度為11.0%，特異度為100.0%(圖2B)。不區(qū)分EGFR-19del和EGFR-L858R類型，ddPCR技術(shù)檢測早期患者ctDNA中EGFR突變顯示，AUC為0.498(95%CI：0.392～0.614)，敏感度為10.2%，特異度為100.0%(圖2C)；在晚期肺癌患者中，EGFR-19del的AUC為0.854(95%CI：0.715～0.976)，敏感度為76.7%，特異度為90.1%(圖2D)，EGFR-L858R的AUC為0.768(95%CI：0.642～0.957)，敏感度為63.4%，特異度為96.8%(圖2E)。不區(qū)分EGFR-19del和EGFR-L858R類型，ddPCR技術(shù)檢測晚期患者ctDNA中EGFR突變顯示，AUC為0.837(95%CI：0.751～0.936)，敏感度為75.2%，特異度為85.1%(圖2F)。綜上所述，ddPCR技術(shù)用于預(yù)測晚期肺癌患者EGFR突變與組織有更高的一致性，說明ddPCR技術(shù)檢測ctDNA中EGFR突變更適用于晚期肺癌患者。

圖2 ddPCR技術(shù)預(yù)測ctDNA中EGFR突變的ROC曲線A.EGFR-19del曲線Ⅰ～ⅢA;B.EGFR-L858R曲線Ⅰ～ⅢA;C.不區(qū)分EGFR突變類型Ⅰ～ⅢA；D.EGFR-19del曲線ⅢB～Ⅳ;E.EGFR-L858R曲線ⅢB～Ⅳ;F.不區(qū)分EGFR突變類型ⅢB～ⅣFigure 2 ROC curve of ddPCR in predicting EGFR mutation in ctDNA

2.3血漿ctDNA可作為預(yù)測遠處轉(zhuǎn)移的替代標(biāo)志物 統(tǒng)計分析患者臨床技術(shù)參數(shù)與ctDNA中EGFR的突變豐度關(guān)系(表1)，結(jié)果顯示，隨著TNM分期的增加，ctDNA中EGFR突變豐度也逐漸增加，在T分期和N分期患者ctDNA中EGFR的突變豐度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；M分期中，有遠處轉(zhuǎn)移與無遠處轉(zhuǎn)移患者ctDNA中EGFR的突變豐度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。不同病理分期、發(fā)生腦轉(zhuǎn)移、發(fā)生骨轉(zhuǎn)移ctDNA中EGFR的突變豐度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Ⅳ期的44例患者中發(fā)生骨轉(zhuǎn)移和腦轉(zhuǎn)移患者分別為(45.4%，20/44)和(36.4%，16/44)，有無腦轉(zhuǎn)移(圖3A)和骨轉(zhuǎn)移(圖3B)患者ctDNA中EGFR突變豐度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。進一步分析發(fā)生多部位轉(zhuǎn)移與ctDNA中EGFR突變豐度的相關(guān)性，結(jié)果顯示，兩者存在較強的相關(guān)性(r=0.510，P<0.001)(圖3C)。

表1 臨床技術(shù)參數(shù)與患者ctDNA中EGFR突變豐度的關(guān)系Table 1 Relationship between clinical and technical parameters and EGFR mutation abundance in ctDNA of patients

圖3 腦、骨和轉(zhuǎn)移位點數(shù)與ctDNA中EGFR突變豐度的關(guān)系A(chǔ).腦轉(zhuǎn)移；B.骨轉(zhuǎn)移；C.轉(zhuǎn)移位點數(shù)Figure 3 Relationship between the number of the brain, bone and metastatic site and EGFR mutation abundance in ctDNA

2.4ctDNA中EGFR突變的存在可能是肺腺癌預(yù)后較差的標(biāo)志 分析102例肺腺癌患者ctDNA中EGFR突變的存在對預(yù)后的影響。結(jié)果顯示：102例患者中，ctDNA中EGFR突變陰性66例(64.7%)，血漿ctDNA中EGFR突變陽性36例(35.3%)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，肺腺癌患者的中位無進展生存時間(progression-free survival，PFS)為23.0個月(95%CI：14.6～27.4個月)，其中ctDNA陽性組PFS明顯短于ctDNA陰性組(13.8個月vs.42.2個月，P<0.05,log-rank檢驗)(圖4A)；總生存期(overall survival,OS)平均時間為(59.2±3.4)個月(95%CI:50.0～64.8個月)，ctDNA陽性組OS短于ctDNA陰性組[(34.4±3.40)個月vs.(66.8±1.78)個月,P<0.05,log-rank檢驗)](圖4B)。此外，對38例組織樣本診斷為EGFR敏感突變陽性并接受EGFR-TKIs治療的肺腺癌患者進行亞組分析，顯示38例患者中，ctDNA中EGFR陽性29例,EGFR陰性9例。統(tǒng)計分析顯示：接受EGFR-TKIs治療的患者中位PFS時間為18.0個月(95%CI:10.26～22.8個月)，其中ctDNA中EGFR陽性組中位PFS比ctDNA陰性組短12個月(12.0個月vs.24.0個月，P<0.05,log-rank檢驗)(圖4C)。綜上所述，肺腺癌患者ctDNA中EGFR的存在提示較差的生存率和較差的EGFR-TKI治療效果。

圖4 ctDNA中EGFR突變與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系A(chǔ).ctDNA陽性組PFS明顯短于ctDNA陰性組;B.ctDNA陽性組OS短于ctDNA陰性組;C.接受EGFR-TKIs治療中ctDNA中EGFR陽性組中位PFS比ctDNA陰性組短Figure 4 Relationship between EGFR mutation in ctDNA and prognosis of patients with lung adenocarcinoma

3 討 論

近年來，隨著各類靶向藥物的發(fā)展，肺癌的治療取得重大突破，而對患者治療過程的全流程監(jiān)控是十分必要的。大量研究表明,“液態(tài)活檢技術(shù)”能夠?qū)崟r監(jiān)測腫瘤的進展[4]。“液態(tài)活檢”主要包括循環(huán)腫瘤細胞CTCs、外泌體和ctDNA，ctDNA是指攜帶腫瘤特定突變信息的血漿游離DNA，是由腫瘤細胞脫落或者凋亡之后釋放到血液循環(huán)系統(tǒng)的DNA片段[5]。血液中腫瘤ctDNA所含的基因突變信息與腫瘤組織具有高度一致性，且ctDNA在腫瘤患者體內(nèi)含量低，約占血漿游離DNA的1%，其半衰期短，有賴于多重PCR，數(shù)字PCR及二代測序技術(shù)的進步，ctDNA已在臨床上得到廣泛的應(yīng)用[6]。多項研究表明，ctDNA在Ⅰ期癌癥患者檢出率為47%，在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期癌癥患者檢出率分別是55%、69%和82%[7-8]，說明ctDNA與腫瘤進展相關(guān)[9]。在晚期肺癌患者的胸腔積液、腦脊液和外周血中均能檢測到EGFR、c-MET及ALK等基因的相關(guān)突變。

本研究主要探討了ddPCR技術(shù)在檢測肺腺癌患者血ctDNA中EGFR突變中的應(yīng)用，比較早期和晚期肺腺癌的ctDNA檢出率。結(jié)果表明，ddPCR技術(shù)僅在晚期肺癌有用，因為早期肺癌ctDNA檢出率相對較低；基于ddPCR技術(shù)的ctDNA基因分型檢測的使用與癌癥分期相關(guān)。既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ctDNA與腫瘤TNM分期相關(guān)。Joo等[10]報道ctDNA與原發(fā)腫瘤大小無關(guān)，但與轉(zhuǎn)移部位數(shù)量顯著相關(guān)。Couraud等[11]指出，ctDNA濃度與腫瘤期和轉(zhuǎn)移部位數(shù)量顯著相關(guān)。Aldea等[5]研究表明，發(fā)生骨轉(zhuǎn)移患者的ctDNA含量較高。本研究結(jié)果顯示，ctDNA與患者遠處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，尤其是骨轉(zhuǎn)移和腦轉(zhuǎn)移。不區(qū)分EGFR基因突變類型情況下，ddPCR技術(shù)檢測ctDNA中EGFR突變狀態(tài)的AUC為0.694，敏感度為40.2%，特異度為88.6%，說明ddPCR技術(shù)用于檢測ctDNA中EGFR突變是可行的。在此基礎(chǔ)上，進一步分析ddPCR技術(shù)檢測ctDNA中EGFR的突變與腫瘤臨床分期與TNM分期的關(guān)系，結(jié)果顯示ddPCR技術(shù)檢測晚期患者ctDNA中EGFR突變的AUC為0.837，且在M期及發(fā)生骨轉(zhuǎn)移或腦轉(zhuǎn)移肺腺癌患者中，ctDNA中EGFR突變豐度較高。最近的研究表明，在接受EGFR-TKIs治療的晚期NSCLC患者中，ctDNA中EGFR基因突變差存在提示較長的PFS和OS。本研究結(jié)果顯示，ctDNA中EGFR基因突變的存在提示著肺腺癌患者有較差的PFS和OS。此外，ctDNA中EGFR突變的存在提示晚期肺癌患者EGFR-TKIs治療的疾病控制時間較短。ctDNA中的EGFR突變提示NSCLC患者接受EGFR-TKIs治療有較差的PFS和OS，表明ctDNA中EGFR突變的存在預(yù)示著較差的預(yù)后[12-15]。

綜上所述，利用ddPCR技術(shù)對ctDNA中EGFR基因突變分析是一種高度敏感度和特異度的檢測方法，尤其適用于晚期非小細胞肺癌患者。ctDNA中EGFR突變是預(yù)測EGFR-TKIs療效及患者有無遠處轉(zhuǎn)移和不良反應(yīng)的生物標(biāo)志物。