生牛乳中耐藥芽孢桿菌的分離鑒定及四環(huán)素抗性基因tetL定位研究

曹澤鈺，陸方舟，楊婧藝，余宛蕓，閆娟，狄文軒，郝彥玲，翟征遠

（1.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.北京農學院食品科學與工程學院，北京 102206；3.中國農業(yè)大學營養(yǎng)與健康研究院，北京 100193）

0 引 言

奶牛養(yǎng)殖中的抗生素使用導致的食品安全問題已成為制約企業(yè)發(fā)展，影響人們健康的重大問題之一。奶牛飼養(yǎng)過程中使用的抗生素，可以防治疾病和促進生長，也導致了原料乳中耐藥細菌累積，如部分耐藥芽孢桿菌。在經(jīng)過巴氏殺菌處理后，部分耐藥芽孢桿菌的芽孢仍然存在于乳中，且在適宜條件下萌發(fā)而形成正常繁殖的營養(yǎng)體，使得巴氏殺菌乳及下游產(chǎn)品含有耐藥芽孢桿菌。這些耐藥芽孢桿菌可能不具有致病性，但其包含的耐藥基因可能在乳制品生產(chǎn)加工過程中水平轉移到其他微生物中，造成潛在的安全問題[1]。

細菌可轉移質粒或染色體上的可移動元件，如IS序列、Tn轉座子等可導致耐藥基因的水平轉移。研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌B.subtilis 168能夠吸收UHT乳環(huán)境中的游離紅霉素抗性質粒[2]；巴氏殺菌乳中分離的蠟樣芽孢桿菌BA117的質粒帶有四環(huán)素抗性基因tetL，并且能夠接合轉移至地衣芽孢桿菌和沙福芽孢桿菌。但對生牛乳中耐熱芽孢桿菌的耐藥基因的定位及耐藥基因可轉移性的研究較少，已有研究結果多集中于抗生素敏感性普查和抗性基因的存在情況。

本研究從34個生牛乳樣品中分離鑒定芽孢桿菌，并利用微量肉湯稀釋法從中篩選抗生素抗性菌株；通過PCR和DNA測序確定耐藥基因；進一步通過反向PCR和質粒序列測定對耐藥基因進行定位。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株、培養(yǎng)基及試劑

1.1.1 材料

34份生牛乳樣品分別采自天津市（11）、河北省廊坊市（4）、江蘇省徐州市（3）、黑龍江省大慶（1）的19個奶牛場，分4個批次采集樣品，時間分別為2021年6月25日、7月8日、9月6日和9月28日。

1.1.2 菌株

質控菌株金黃色葡萄球菌ATCC29213由中國食品藥品檢定研究院惠贈。攜有tetL基因的蠟樣芽孢桿菌BA117為本實驗室保藏菌株。攜有tetL基因的蠟樣芽孢桿菌CAU 17由中國農業(yè)大學朱奎教授惠贈。接合轉移受體菌副地衣芽孢桿菌BA103為本實驗室保藏菌株。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，去離子水定容至1 L，p H 7.0，用于質控菌株的培養(yǎng)；

NB培養(yǎng)基：牛肉浸粉5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，去離子水定容至1 L，p H 7.1±0.1，用于芽孢桿菌的培養(yǎng)。

1.1.4 試劑

牛肉浸粉、甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂培養(yǎng)基（MYP），北京奧博星生物技術有限責任公司；蛋白胨、酵母粉，OXOID；氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀，國藥集團化學試劑有限公司；藥敏檢測板，上海星佰生物技術有限公司；四環(huán)素、克林霉素，中國食品藥品檢定研究院；紅霉素、甲氧芐啶、磺胺甲惡唑，Sigma；可換膜濾器、0.45μm水系濾膜，購自寶如億（北京）生物技術有限公司；金牌M IX，北京擎科新業(yè)生物技術有限公司；TaKaRa PCR Amplification Kit，TAKARA Bio；質粒小提試劑盒，Omega bio-tek。

1.2 主要儀器和設備

生物安全柜，Thermo Fisher Scientific；冷凍離心機,eppendorf；金屬浴，天根生化科技（北京）有限公司；PCR儀和電泳儀，Bio-Rad；凝膠成像系統(tǒng)，UVP；酶標儀，Tecan。

1.3 實驗方法

1.3.1 芽孢桿菌的分離與鑒定

依據(jù)國家標準[3]并作適當調整，為了提高芽孢桿菌的分離率，對生牛乳樣品進行80℃熱處理20 min后，進行分菌。進一步利用試劑盒提取芽孢桿菌基因組DNA，以基因組為模板，擴增16S rDNA片段，16S rDNA PCR引物由上海生工生物科技有限公司合成。正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物1492R：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反應程序：98℃預變性2 min；98℃變性10 s，52℃退火30 s，72℃延伸40 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物送至北京擎科新業(yè)生物技術有限公司進行雙向測序，測序結果上傳NCBI數(shù)據(jù)庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行比對分析，確定菌株的種屬。

1.3.2 芽孢桿菌的耐藥性評價

依據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會（The Clinical&Laboratory Standards Institute,CLSI）[4]建議的微量肉湯稀釋法，對66株產(chǎn)芽孢細菌分離株進行藥敏試驗，該方法注明質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213。共篩查分離株對11大類共12種抗生素的敏感性，分別為氨芐西林，青霉素，美羅培南，紅霉素，克林霉素，環(huán)丙沙星，利福平，復方新諾明，萬古霉素，四環(huán)素，氯霉素，慶大霉素。根據(jù)2016版CLSI不常見或苛養(yǎng)菌藥敏方法M 45中芽孢桿菌耐藥性判定標準進行耐藥性評價。

1.3.3 攜帶獲得性耐藥基因的芽孢桿菌的質粒普查

為了確定獲得性耐藥基因是否存在質粒上，使用E.Z.N.A Plasmid Mini Kit試劑盒提取質粒，通過瓊脂糖凝膠電泳普查獲得性耐藥芽孢桿菌質粒存在情況。

1.3.4 四環(huán)素耐藥基因的特異性PCR檢測

根據(jù)芽孢桿菌四環(huán)素耐藥基因tetA、tetB、tetO、tetW、tetK、tetM和tet L的序列及參考文獻，設計引物如表1所示，以四環(huán)素耐藥的芽孢桿菌的基因組和質粒DNA為模板，PCR擴增四環(huán)素耐藥基因，并對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測。

表1 四環(huán)素抗性基因擴增引物

1.3.5 反向PCR

依據(jù)冷泉港實驗室（The Cold Spring Harbor Laboratory,CHL）[9]的方法，依據(jù)PCR擴增到的tet L抗性基因序列設計引物Inverse-F-5’GCTGGTGCTGGAATGAGTTTG 3'，Inverse-R-5'TTGGTT GTGTCGTAAATTCG 3'，反向PCR確定四環(huán)素抗性基因上下游序列。

2 結果與討論

2.1 生牛乳中芽孢桿菌的分離與鑒定

從34個生牛乳樣品中分離并鑒定出66株產(chǎn)芽孢細菌，其中蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）38株（58%）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）3株（5%）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）3株（5%）、沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis）2株（3%）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）3株（5%）、高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）1株（2%）、摩加夫芽孢桿菌（Bacillus mojavensis）1株（2%）、越南芽孢桿菌（Bacillus wiedmannii）2株（3%）、魏登施泰芽孢桿菌（Bacillus weihenstephanensis）1株（2%）、漳州芽孢桿菌（Bacillus zhangzhouensis）2株（3%）、副黏菌芽孢桿菌（Bacillus paramycoides）4株（6%）、其他芽孢桿菌6株（9%）。

圖1 生牛乳中芽孢桿菌分離情況

2.2 芽孢桿菌抗生素抗性篩查

對66個分離株進行藥敏試驗，共篩選出57株抗生素抗性菌株，分別為氨芐西林抗性（47株），青霉素抗性（50株），紅霉素抗性（1株），克林霉素抗性（7株），四環(huán)素抗性（5株）。分離株均未表現(xiàn)出對美羅培南、環(huán)丙沙星、利福平、萬古霉素、氯霉素、慶大霉素、復方新諾敏的抗性。菌種與抗生素抗性對應關系如表2。分離株中芽孢桿菌普遍對氨芐西林、青霉素具有抗性，表明氨芐西林、青霉素屬于固有抗性。而四環(huán)素、紅霉素和克林霉素抗性表型在分離株中并不具有普遍性，因此可能是菌株的獲得性抗性。

表2 芽孢桿菌分離株耐藥表型（n=66）

（續(xù)表2）

2.3 獲得性耐藥菌的質粒普查

為進一步定位獲得性耐藥菌株的耐藥基因并探究其可移動性，使用質粒小提試劑盒，對13株具有獲得性耐藥表型的芽孢桿菌進行質粒提取。瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明僅有四環(huán)素抗性的蠟樣芽孢桿菌S7和S11攜帶有質粒。如圖2所示，通過同超螺旋DNA marker的比較，蠟樣芽孢桿菌S7存在一個約5 kb的質粒，蠟樣芽孢桿菌S11存在約2 kb的質粒。

圖2 蠟樣芽孢桿菌S7、S11質粒電泳圖

2.4 四環(huán)素抗性基因的PCR擴增及定位

分別以S7、S11的質粒、基因組為DNA模板，擴增芽孢桿菌四環(huán)素耐藥基因，擴增產(chǎn)物電泳圖如圖3。未見S7、S11質粒與基因組擴增出tetO清晰條帶，tetA、tet B、tet W、tet K、tetM擴增產(chǎn)物均與參考文獻中不符，測序分析表明均為非特異性擴增片段。使用tet L上下游引物，兩株菌的質粒與基因組都擴增出略大于750 bp的條帶，片段大小與文獻相符。序列的比對分析發(fā)現(xiàn)擴增產(chǎn)物同tetL基因相似度達到100%，表明蠟樣芽孢桿菌S7、S11中有tetL基因。以S7的質粒DNA為模板能夠擴增獲得tetL基因片段，說明tetL基因可能位于S7的質粒上。

圖3 四環(huán)素抗性基因PCR擴增結果

為了定位tetL基因，以經(jīng)純化的S7質粒為模板，反向擴增tetL兩側基因，擴增產(chǎn)物電泳圖譜如圖4所示，CK為雙蒸水代替模板的陰性對照。S7存在一條明顯的約4 kb的條帶。將S7擴增產(chǎn)物交由公司測序，產(chǎn)物序列與tetL序列拼接成環(huán)，獲得質粒p BCs7的全序列，質粒大小為4 634 bp。對質粒全序列進行注釋后，用Snap Gene繪制該質粒的物理圖譜，如圖5所示。該質粒包含四環(huán)素抗性基因tetL、兩個移動蛋白基因mob_1和mob_2、質粒復制蛋白基因repU。質粒p BCs7能夠編碼的移動蛋白M ob，而M ob蛋白一般能夠介導質粒的接合轉移。對質粒p BCs7的核酸序列進行Blast比對分析，發(fā)現(xiàn)其同Heyndrickxia oleronia FW 1的質粒p AMalpha1（GenBank:CP079722.1）相似度為99.76%；同屎腸球菌E7654的質粒4（GenBank:LR 135327.1）相似度為99.75%；同金黃色葡萄球菌X 22的質粒（GenBank:CP042651.1）相似度為99.74%。因此，推測質粒p BCs7可能具有轉移性，蠟樣芽孢桿菌S7可能成為四環(huán)素耐藥基因的供體菌。盡管我國乳制品生產(chǎn)標準中尚未要求對芽孢桿菌進行檢測，攜帶有可移動的耐藥基因的芽孢桿菌已經(jīng)成為影響乳制品安全的潛在風險之一。研究表明，減少飼養(yǎng)環(huán)節(jié)的抗生素使用，改善養(yǎng)殖環(huán)境或擠奶過程的衛(wèi)生條件，可以有效降低原料乳中耐藥菌的數(shù)量[10]。在乳制品生產(chǎn)過程中，利用離心除芽孢機可以大幅降低原料乳中芽孢數(shù)量[11]，可以降低芽孢桿菌的耐藥基因的傳播。

圖4 反向PCR電泳圖

圖5 pBCs7質粒物理圖譜

3 結 論

本研究從34個生牛乳樣品中分離鑒定出66株產(chǎn)芽孢細菌，包括蠟樣芽孢桿菌38株、地衣芽孢桿菌3株、短小芽孢桿菌3株、沙福芽孢桿菌2株、枯草芽孢桿菌3株、高地芽孢桿菌1株、摩加夫芽孢桿菌1株、越南芽孢桿菌2株、魏登施泰芽孢桿菌1株、漳州芽孢桿菌2株、副黏菌芽孢桿菌4株、其他芽孢桿菌6株。藥敏結果顯示，在固有抗生素耐藥性中氨芐西林耐藥率高達71.21%，青霉素耐藥率高達75.75%。在獲得性耐藥中7株芽孢桿菌具有克林霉素抗性，1株沙福芽孢桿菌具有紅霉素抗性，5株蠟樣芽孢桿菌具有四環(huán)素抗性。獲得性耐藥的菌株中，四環(huán)素抗性的蠟樣芽孢桿菌S7和S11攜帶有質粒。進一步通過芽孢桿菌四環(huán)素耐藥基因的PCR篩查及測序分析，確定S7和S11中四環(huán)素抗性基因為tetL。其中蠟樣芽孢桿菌S7的tetL基因位于質粒上。通過反向PCR及DNA測序，獲得該質粒p BCs7的全序列。該質粒大小為4634 bp，包含四環(huán)素抗性基因tetL、兩個移動蛋白基因mob_1和mob_2、質粒復制蛋白基因repU。移動蛋白M ob能夠介導質粒的水平轉移，所以推測p BCs7上的四環(huán)素抗性基因tetL可能具有轉移性。本研究結果說明，生牛乳中耐藥芽孢桿菌具有四環(huán)素、克林霉素和紅霉素等獲得性抗生素抗性，其中四環(huán)素抗性基因tetL位于可移動元件上，可能通過接合轉移方式在菌株之間傳播，具有一定的食品安全風險。