浙江省溫州地區老年住院患者耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌藥敏、耐藥表型及毒力因子研究

金曉立，賴冬紅，胡楊妃，丁思思，沈麗珍，陳楊芳，毛曉曄，曾云祥

肺炎克雷伯菌（KP）屬革蘭陰性桿菌，近年來在社區和醫院獲得性感染中常見，引起臨床關注[1-2]。耐碳青霉烯類（CR）藥物是治療KP有效的廣譜抗菌藥物，但由于近年臨床抗菌藥物的濫用，導致KP對CR的耐藥率逐漸升高，常表現為多重耐藥或廣泛性耐藥，極易傳播。在2014-2019年的我國流行病學調查中可見CRKP的檢出率從6.4%上升至10.9%[3]。KP依據細菌的毒力程度可分為高毒力KP和普通KP，高毒力KP較普通KP更容易傳播，且更具有侵襲性，可造成嚴重的系統性感染，危害患者的生命安全[4-5]。既往認為KP的耐藥性和高毒力性并不得以共存，而由于臨床抗菌藥物的不合理使用，耐藥及毒力質粒在細菌之間快速傳播，高毒力菌株也逐漸開始出現，且逐年增加的趨勢，為臨床治療帶來了極大困難[6]。目前對于高毒力菌株的定義尚不明確，多認為高黏表型合并攜帶毒力基因為高毒力菌株，故本研究對浙江省溫州地區的老年住院患者臨床KP進行分析，探討CRKP藥敏及高黏表型CRKP耐藥表型、毒力因子特點，為臨床治療提供輔助信息，報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 選取2018年3月至2022年3月在浙江省溫州市地區各醫院收治住院的老年患者（年齡≥60歲）中分離的CR KP菌株，去除同一患者相同部位的重復菌株，共得112株。其中溫州市中醫院98株，溫州市中西醫結合醫院9株，溫州市人民醫院3株，溫州市泰順縣中醫院2株。將收集菌株采用冷凍干燥法進行保存待用。本研究經溫州市中醫院倫理委員會審核通過。

1.2 試劑和儀器 VITEK-2全自動微生物分析儀及配套藥敏卡采自法國生物梅里埃公司，ASLAN-96p實時熒光定量PCR儀采自上海宏石醫療科技有限公司，DYY-6C型電泳儀采自上海標卓科學儀器有限公司，SPX-250B生化培養箱采自上海躍進醫療器械廠，瓊脂糖凝膠電泳試劑盒、PCR引物、PCR反應混合液采自上海生工生物技術有限公司，Goldview I型核酸染色劑采自北京索萊寶科技有限公司，菌種接種血平板及肉湯培養基均采自溫州康泰生物試劑公司，GeL Documentation基因紫外成像儀采自上海之江生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定及藥敏試驗 菌株鑒定均由VITEK-2全自動微生物分析儀進行鑒定，并利用配套藥敏卡進行菌株藥敏試驗，包括亞胺培南、厄他培南、頭孢吡肟、頭孢替坦、哌拉西林/他唑巴坦等。參照美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）的標準[7]進行結果判斷，質控菌株為KP ATCC700603和大腸埃希菌ATCC25922。

1.3.2 拉絲試驗（ST）利用ST檢驗高黏表型CR KP菌株，將待測菌接種于血平板上，在37℃條件下進行16～18 h的培養后，用接種環輕輕向上挑取菌落，觀察黏液絲長度。黏液絲長度＜5 mm或連續3次均未見黏液絲被挑起則為ST陰性；反之則為陽性，判定陽性為高黏表型菌株。

1.3.3 高黏表型CRKP菌株耐藥基因、血清莢膜型、毒力基因檢測 采用煮沸法進行DNA模板制備，PCR擴增高黏表型CR KP菌株的碳青霉烯耐藥基因、血清莢膜分型及毒力基因。PCR反應條件：94℃，5 min預變性；94℃變性30 s，退火30 s（各基因序列及退火溫度見表1），72℃延伸1 min，72℃再延伸10 min，擴增35個循環。取PCR擴增產物5.0l，用2.0%瓊脂糖凝膠電泳（100 mV）檢測，反應產物由紫外燈照射觀察條帶位置和亮度，PCR產物送上海生物工程公司測序，并將序列與美國Blastn公司的分析軟件進行分析。

表1 高黏表型CRKP菌株耐藥基因、血清莢膜型及毒力基因引物序列及反應參數

1.4 統計方法 以雙人核對法進行數據的整理和錄入，使用SPSS 21.0統計軟件進行分析，計數資料比較采用2檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CR KP菌株分布情況及藥敏結果 112株CR KP分離至112例患者，其中男76例（76株），女36例（36株）；平均年齡（70.7±13.5）歲，其中＞65歲73例，占比65.18%。分別來源于6種不同的標本類型，其中以尿液（47.32%）和痰液（42.86%）為主，見圖1。藥敏結果顯示，對亞胺培南、厄他培南耐藥率均達98.21%，對阿米卡星、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑具有較好的藥物敏感性，分別為56.25%、54.46%，見表2。

表2 112株CRKP藥敏結果 株（%）

圖1 CRKP菌株分布情況

2.2 高黏表型CR KP菌株分布及藥敏結果 共檢出18株高黏表型CR KP菌株，檢出率為16.07%。其中男10例，女8例；平均年齡（71.9±15.7）歲，其中＞65歲12例，占比66.67%。分別來自3種不同的標本類型，以痰液為主（61.11%），見圖2。18株高黏表型CR KP菌株對甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素具有較好的藥物敏感性，分別為72.22%、61.11%、55.56%、55.56%，見表3。

表3 18株高黏表型CR KP菌株藥敏結果 株（%）

圖2 高黏表型CRKP菌株分布情況

2.3 高黏表型CRKP菌株耐藥基因、血清莢膜型檢測結果 18株CR-HvKP均攜帶KPC，其中有3株共同攜帶GES（16.67%），1株共同攜帶NDM（5.56%）；血清莢膜型以K1型（11.11%）、K2型（11.11%）為主，有13株未分型，未見K20、K54、K57型，見表4。

表4 高黏表型CR KP菌株耐藥基因、血清莢膜型檢測結果

2.4 高黏表型CR KP菌株毒力基因檢測結果 共有12株高黏表型CR KP菌株攜帶毒力基因，其中rmpA攜帶率為61.11%，Iron攜帶率為61.11%，4株攜帶aerobactin攜帶率為22.22%，magA攜帶率為11.11%，見表5。

表5 高黏表型CR KP菌株毒力基因檢測結果

3 討論

2017年浙江省的CRKP總體分離率達6.2%[8]，而在2021年浙江溫州地區的CR KP的分離率高達14.50%，檢出率較高，對防治CR KP的臨床工作仍任重道遠。本研究結果顯示，112株CR KP菌株來源以＞65歲的老年患者居多，可能與老年患者多合并基礎疾病，身體機能和免疫力下降，住院時間長有關。標本來源以尿液和痰液居多，與其他地區既往研究相似[9]。藥敏試驗結果顯示，本組112株CRKP菌株對亞胺培南、厄他培南抗菌藥呈現出高水平耐藥，耐藥率均高達98.21%，與文獻[10-11]結果相似。而對阿米卡星、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑的藥物敏感性仍未超過60%，這提示臨床應加強抗菌藥物的管理，規避不合理用藥，以降低KP對碳青霉烯類藥物的耐藥率。

高毒力菌株可引起多種重要器官的感染，致病性較高[12]。而高黏表型與高毒力密切相關，本研究ST發現，存在18株高黏表型CR KP菌株，檢出率為16.07%，與文獻[13]結果相近。本次檢出的高黏表型CRKP菌株多來源于痰液，可能與老年患者多存在肺部感染有關。藥敏結果顯示，高黏表型CR KP菌株對亞胺培南、厄他培南、氨芐西林/舒巴坦的耐藥率達到了100.00%，符合其高耐藥性；但對阿米卡西和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑的敏感性超過了60%，這提示臨床治療高黏表型CR KP菌株感染可優先考慮此類藥物。本研究顯示，高黏表型CR KP菌株均攜帶KPC基因，攜帶率達100%，與文獻[14]結果相近。這說明高黏表型CR KP菌株的主要耐藥機制為產KPC型碳青霉烯酶，這也是對氨基糖苷類、磺胺類藥物的敏感性較好的原因之一。細胞莢膜K1和K2型被認為是具有高毒力的莢膜血清型，本研究顯示，18株高黏表型CRKP菌株細胞莢膜型檢出以K1和K2檢出為主，與文獻[15]結果一致。這可能也是其對碳青霉烯酶類藥物產生高耐藥性，更易發生感染遷徙的原因。

本研究發現，共有12株高黏表型CR KP菌株攜帶毒力基因，其中以攜帶rmpA、Iron基因為主。rmpA為KP高黏表型調節因子，可激活莢膜的合成，有增強菌株毒力的作用，既往也有研究顯示高毒力KP分離株中多見rmpA基因的存在[13-14]。Iron和aerobactin均為KP分泌的鐵載體，介導者細菌與宿主細胞的黏附，既往多以aerobactin基因多見，但在本研究中僅4株攜帶aerobactin，文獻[15]研究結果不一致，這可能與地區不一有關。

綜上所述，高黏表型CRKP菌株在溫州地區老年住院患者中的檢出率較高，標本主要來源于痰液，耐藥基因機制可能為產KPC型碳青霉烯酶，血清莢膜型以K1和K2為主，毒力基因以rmpA、Iron基因攜帶率最高。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 金曉立：實驗操作、論文撰寫；曾云祥：實驗設計、論文修改；賴冬紅：樣本收集、實驗操作；胡楊妃、丁思思：數據整理、統計學分析；沈麗珍、陳楊芳、毛曉曄：實驗指導、菌株提供