肺腺癌術中冰凍切片與術后石蠟切片診斷的符合率分析

邵晨寧，黃國慶，李明才

根據2011年IASLC/ATS/ERS肺腺癌國際多學科分類，將肺腺癌分為非典型腺瘤樣增生（AAH）、原位腺癌（AIS）、微浸潤性腺癌（MIA）和浸潤性腺癌（IAC）[1]。手術切除是肺腺癌的主要治療方式，《中華醫學會腫瘤學分會肺癌臨床診療指南（2021版）》推薦AIS和MIA行亞肺葉切除術，IAC通常需要全肺葉切除。在早期肺癌中，亞肺葉切除與肺葉切除相比，患者的總生存率和癌癥特異性生存率沒有差異[2-3]。手術醫生基于術中冰凍診斷來選擇肺葉切除或者亞肺葉切除，因此，在術中準確做出肺腺癌的分類診斷至關重要[4]。本研究回顧性收集經石蠟切片確診為肺腺癌并做過術中冰凍切片的病例823例，以石蠟切片診斷為“金標準”，對比分析冰凍切片診斷對肺腺癌分類診斷的符合率，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以肺腺癌為關鍵詞，收集2020年9月至2021年4月送檢寧波市臨床病理診斷中心的術中冰凍切片診斷為肺腺癌的病例823例，合計病灶934個，均經術后石蠟切片診斷確診。其中男222例，女601例；年齡18～85歲，平均（53.7±13.7）歲。本研究經寧波大學醫學院倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 術中冰凍切片診斷方法 標本為手術中送檢的新鮮肺組織，高年資病理醫生取可疑結節處放于樣本托，多病灶肺組織按需取多塊組織，膠水包埋，將樣本托置于賽默飛FSE恒溫冷凍切片機的速凍臺，當觀察到膠水及組織下半部顏色變白呈冰凍狀態時，輕輕地將凍錘壓于組織上，待組織完全冰凍后切片，切片厚度6m，貼片后立即甲醇固定1 min，蘇木素伊紅染色，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠濕封，顯微鏡觀察。

1.2.2 術后石蠟切片診斷方法 將冰凍及冰剩組織用10%中性緩沖甲醛充分固定后，放入達科為全自動脫水機進行脫水浸蠟處理，取出后包埋，用LEICA2235輪轉式切片機切片，切片厚度4m，DAKO全自動染封一體機染色封片，鏡下觀察。

1.3 診斷結果判讀 冰凍切片結果均由高年資病理醫生判讀，其中的疑難片通過科內會診判定；石蠟切片中的疑難片通過科內復片會診，加做免疫組化或組織化學特殊染色等方式進行判定。以石蠟切片診斷結果為“金標準”，將冰凍切片結果分為確診和誤診，確診又包括：（1）完全符合：指冰凍和石蠟切片診斷完全一致；（2）基本符合：良惡性一致，惡性的分類（浸潤程度）不一致。誤診：指冰凍和石蠟的良惡性不符，假陽性是指將良性診斷為惡性，假陰性是指將惡性診斷為良性。

1.4 統計方法 采用SPSS 22.0統計軟件進行分析，冰凍切片和石蠟切片兩種方法的良惡性診斷差異采用Kappa一致性檢驗和配對2檢驗，兩種方法對病灶分類診斷的差異采用配對2檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 冰凍切片和石蠟切片的良惡性結果比較 為求精確，以單個病灶為對比樣本。本組合計934個病灶，冰凍切片的陽性診斷率為99.1%，石蠟切片的陽性診斷率為99.3%；兩種方式對良惡性的診斷結果基本一致，但一致性中等（Kappa=0.530，P＞0.05），見表1。

表1 冰凍切片和石蠟切片的良惡性結果 個

2.2 冰凍切片和石蠟切片的分類診斷結果比較 冰凍切片與石蠟切片結果完全符合690個（73.88%），基本符合237個（25.37%），誤診7個（0.75%），兩者的分類診斷差異有統計學意義（P＜0.001），見表2。

表2 冰凍切片和石蠟切片的分類診斷比較 個

2.3 冰凍切片和石蠟切片的HE染色 可見冰凍切片相對于石蠟切片細胞稍腫脹，細胞核結構稍顯模糊，操作不當時容易出現冰晶，組織結構易變形，見圖1～2。

圖1 冰凍切片和石蠟切片（HE染色，×40）

3 討論

亞肺葉切除術已被臨床作為AIS和MIA的首選治療方式[5]，但國際上對肺癌術中冰凍切片診斷的看法不一，有學者認為冰凍切片診斷誤差較大且影響因素太多，對手術方式的選擇有重大影響[6-8]；也有學者認為冰凍診斷與石蠟診斷符合率較高，對手術方式選擇有極高的參考價值[9-12]。本研究結果顯示兩種制片方式的良惡性診斷一致性一般，分類診斷差異有統計學意義，這與文獻[8-9，13]報道結果相似。分類診斷差異具體表現在：（1）冰凍診斷對AIS和MIA的區分存在困難；（2）冰凍診斷對IAC的診斷難度較大，易將IAC診斷為MIA。臨床上，AIS和MIA的手術處理方式一樣，所以這兩者的冰凍結果區分意義不大[9-10]。IAC通常需要全肺葉切除及淋巴結清掃，對患者預后影響重大，所以必須提高術中IAC診斷的準確率。因此本研究重點關注IAC診斷出現偏差的原因。

圖2 冰凍切片和石蠟切片（HE染色，×200）

本研究結果顯示有80個病灶冰凍切片診斷為MIA，石蠟切片診斷為IAC，冰凍診斷過于保守。分析原因如下：第一，送檢組織的取材偏差。冰凍取材全憑肉眼觀察和經驗，這與取材醫生的主觀判斷大有關系，所以冰凍取材很難達到常規取材的完整、全面。有學者認為全面取材可能可以降低診斷偏差，但在實際操作中存在困難。第二，冰凍切片質量影響較大。腫瘤細胞是否有間質或肺泡腔內的聚集及浸潤灶的大小，是肺腺癌分類診斷的依據。在冰凍制片時，凍錘的使用時機至關重要，因肺不是實性組織，使用過早易將組織塊壓扁變形，使用不及時則會產生冰晶增加細胞的異形性，影響診斷。且未經固定的肺泡腔容易塌陷，使得貼壁的腫瘤細胞聚集在肺泡腔內，對浸潤深度的判讀產生干擾。再者，通常冰凍切片不會深切，而常規制片顯示出更進一步的浸潤，這種情況偶有發生。第三，冰凍切片判讀的偏差。當冰凍切片的鏡下表現不明確時，不同病理醫生可能有不同的判斷。因術中冰凍要求在30 min內報告結果，除去制片時間，留給診斷醫生的時間不多，壓力不言而喻，以至于在診斷時偏向于保守。另外，冰凍切片比石蠟切片厚，在鏡下會看到細胞重疊，新鮮未經固定的細胞稍大，核也容易腫脹變形，這些都加大了診斷難度。

盡管冰凍切片對肺腺癌的分類診斷一致性還存在爭議，但術中冰凍切片診斷已經廣泛運用在外科手術中，因此，如何提高其準確率是病理醫師努力的方向。針對以上分析作如下建議：第一，手術醫生在冰凍申請單上應盡可能詳細地填寫病史、影像資料及手術所見等，肺組織應盡快送檢，避免沾水。對微小病變最好染色或者系線標記，以協助病理醫生快速找到病灶。病理醫生在取材時應注意取材刀鋒利，避免來回拉鋸損傷細胞。第二，冰凍切片應由經驗豐富的病理技術員制作，肺組織要求快速冷凍，有條件的單位可以使用液氮來速凍組織。以石蠟切片為質量標準，制片過程嚴格按照規定步驟，切片完整，細胞結構清晰，無胞內胞外冰晶。另外，從理論上講，肺泡只要恢復到擴張狀態，肺泡腔內有無腫瘤細胞侵襲一目了然。針對新鮮肺泡容易塌陷，研究人員提出了肺泡充氣法來解決這一難題，此法能夠達到擴張肺泡、減少干擾因素的目的，但因實際操作存在困難，還未得到廣泛應用[14-15]。第三，提升病理醫生的專業水平也是提高準確率的關鍵。遇到疑難病例時，盡可能取可疑部位制片，看片時把握原則綜合分析，也可通過多人共覽或者遠程會診降低誤讀。同時病理醫生應勤于與手術醫生溝通，減少不必要的誤會。

綜上所述，冰凍切片在規范操作下，對肺腺癌的良惡性診斷參考性較高，對手術方式具有指導意義，但是對肺腺癌的分類診斷結果存在一定的不符合率。現更應探索的是如何減少干擾冰凍切片診斷的因素，改進冰凍切片制作的方法，提高肺腺癌分類診斷的一致性。

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