DDIT3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)在黏液樣脂肪肉瘤診斷中的意義

孟麗，步鵬，雷穎，趙國(guó)海，靳佩玉，徐恩偉

（1 山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，太原030000；2 山西省腫瘤醫(yī)院·中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院山西醫(yī)院·山西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，太原 030013）

脂肪肉瘤是來源于原始間葉組織的惡性腫瘤，是成人最常見的軟組織腫瘤，占軟組織肉瘤的25%～30%。脂肪肉瘤有不同亞型，包括高分化脂肪肉瘤、去分化脂肪肉瘤、黏液樣/圓細(xì)胞脂肪肉瘤、多形性脂肪肉瘤、黏液樣多形性脂肪肉瘤[1]，其中黏液樣脂肪肉瘤（myxoid liposarcoma, MLP）占所有脂肪肉瘤的25%～50%[2]。僅靠形態(tài)學(xué)無法準(zhǔn)確區(qū)分各個(gè)脂肪肉瘤亞型，并且有些MLP 組織內(nèi)有圓形細(xì)胞區(qū)，當(dāng)圓形細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的5%以上[3]，稱為高級(jí)別MLP，部分高級(jí)別MLP 以圓形細(xì)胞成分為主時(shí)，其難以與其他圓細(xì)胞腫瘤區(qū)分，純黏液樣脂肪肉瘤代表腫瘤中高分化成分，圓細(xì)胞脂肪肉瘤代表腫瘤中低分化的成分，兩者的遺傳學(xué)改變相同。95%的MLP 存在FUS‐DDIT3 融合基因，相較于通過熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, FISH）鑒定DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子3（DNA‐damage inducible transcription3, DDIT3）重排，或通過實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)融合轉(zhuǎn)錄體，免疫組織化學(xué)方法更加便捷，快速和廉價(jià)。本研究旨在評(píng)估DDIT3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)診斷MLP 的可靠性，及其在MLP 鑒別診斷中的意義。

材料與方法

1 材料

收集山西省腫瘤醫(yī)院病理科2014 至2021 年經(jīng)FISH 檢測(cè)確診的MLP（手術(shù)前未接受過放化療等與腫瘤相關(guān)的治療）存檔蠟塊42 例，其中20 例為高級(jí)別；男性29 例，女性13 例，年齡22 ～90 歲，平均年齡51±13 歲。腫瘤發(fā)生部位以大腿多見，共29 例（70%）；其次為小腿和腹股溝，分別為4 例和2 例；其他7 例分別位于上臂、肩背部、腰部等部位。另外選取其他圓細(xì)胞腫瘤及高分化脂肪肉瘤蠟塊73 例作為對(duì)照，包括20 例高分化脂肪肉瘤伴間質(zhì)黏液變性、13 例橫紋肌肉瘤（包括腺泡狀橫紋肌肉瘤和胚胎性橫紋肌肉瘤）、10 例尤文肉瘤、10例滑膜肉瘤、10 例間葉性軟骨肉瘤、10 例促結(jié)締組織增生性小圓細(xì)胞腫瘤。研究遵循的程序經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審批編號(hào)：202237。

2 方法

所有標(biāo)本均由10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，重新進(jìn)行切片和常規(guī)HE 染色，由2 名病理科醫(yī)師重新閱片以明確診斷。用于免疫組織化學(xué)染色的石蠟組織切片厚度均為3 μm，應(yīng)用羅氏公司Bench‐MarkXT 全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀進(jìn)行Envision法免疫組織化學(xué)染色，兔抗DDIT3（phospho S30）第一抗體（美國(guó)Abcam 公司）稀釋度為1 ∶100，第二抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（羅氏上海診斷產(chǎn)品有限公司），工作濃度為40 μg/mL。免疫組織化學(xué)染色后蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片而后光鏡下閱片。

3 結(jié)果判讀

DDIT3 陽性定位于細(xì)胞核，以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。根據(jù)陽性腫瘤細(xì)胞的百分比評(píng)分：＜5%為0 分、6%～50%為1 分、51%～70%為2分、＞71%為3 分；染色強(qiáng)度評(píng)分：強(qiáng)陽性為3 分、中等強(qiáng)度陽性為2 分、弱陽性為1 分、陰性為0 分。以陽性百分比與染色強(qiáng)度評(píng)分的乘積定義DDIT3 在MLP 中的表達(dá)情況，≥2 分為高表達(dá)，1 分為低表達(dá)，0 分為陰性。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS25.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩獨(dú)立樣本間的比較采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson 卡方檢驗(yàn)，當(dāng)理論數(shù)小于5 時(shí)，采用Fisher 確切檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

大體標(biāo)本上，以黏液為主的MLP 表現(xiàn)為多結(jié)節(jié)狀，切面呈膠凍樣，通常無壞死；以圓形細(xì)胞為主的區(qū)域表現(xiàn)為不透明灰白色結(jié)節(jié)、魚肉樣外觀。HE染色顯微鏡下觀察顯示，低級(jí)別區(qū)域腫瘤呈多結(jié)節(jié)狀生長(zhǎng)，結(jié)節(jié)之間可見纖維性間隔，結(jié)節(jié)內(nèi)細(xì)胞密度不等，通常腫瘤周邊顯示細(xì)胞較豐富；腫瘤細(xì)胞由形態(tài)較一致的原始間葉細(xì)胞（圖1C）與印戒樣脂肪母細(xì)胞（圖1C）混合構(gòu)成，間質(zhì)有豐富的黏液，可見多量樹枝狀毛細(xì)血管網(wǎng)（圖1A）；部分病例黏液樣基質(zhì)可形成黏液湖，形成肺水腫樣形態(tài)學(xué)表現(xiàn)（圖1B）。腫瘤細(xì)胞罕見壞死及核分裂像。高級(jí)別MLP 細(xì)胞密度明顯增加，呈實(shí)性片狀分布，可見數(shù)量不等的脂肪母細(xì)胞，低倍鏡下呈“小藍(lán)圓”細(xì)胞成片聚集（圖1D）。

圖1 MLP 組織病理學(xué)特征（HE 染色）。A，黏液背景下毛細(xì)血管網(wǎng)呈樹枝狀，星號(hào)示黏液背景，箭頭示樹枝狀毛細(xì)血管；B，肺水腫樣結(jié)構(gòu)；C，MLP 由形態(tài)較一致的原始間葉細(xì)胞與印戒樣脂肪母細(xì)胞混合構(gòu)成，黑箭示印戒樣脂母細(xì)胞；白箭示原始間葉細(xì)胞；D，高級(jí)別MLP，白箭示成片聚集的“小藍(lán)圓”細(xì)胞。比例尺：A，40 μm；B，125 μm；C，20 μm；D，20 μmFig.1 The histopathological features of MLP (HE staining). A, branching capillary network in a mucoid background, * indicating mucoid background,and arrowhead showing branching capillaries; B, pulmonary edema‐like pattern; C, MLP composed of uniform primitive mesenchymal cells and signet ring‐like lipoblasts, black arrow indicating signet ring‐like lipoblasts, and white arrow showing primitive mesenchymal cells; D, high‐grade MLP, white arrows indicating clusters of “small blue round” cells. Scale bars: A, 40 μm; B, 125 μm; C, 20 μm; D, 20 μm

免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示，42 例MLP 病例中DDIT3 陽性表達(dá)率為100%，高表達(dá)率為83.3%（35/42），其中35 例高表達(dá)，呈彌漫性中等至強(qiáng)染色；7 例低表達(dá)（圖2）；部分MLP 低表達(dá)的原因可能由于蠟塊保存時(shí)間過久或保存不當(dāng)，而失去了部分抗原性。在圓細(xì)胞腫瘤對(duì)照組中，DDIT3 高表達(dá)率為5.7%（3/53），有2 例滑膜肉瘤、1 例尤文肉瘤DDIT3 高表達(dá)，其余病例腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度均低于實(shí)驗(yàn)組，染色強(qiáng)度只有1 分，且染色不均勻，呈局灶陽性或者陰性（圖3）。DDIT3 在MLP 中的表達(dá)水平明顯高于圓細(xì)胞腫瘤組（表1），表明DDIT3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)對(duì)于區(qū)分MLP 尤其是高級(jí)別MLP和其他圓細(xì)胞腫瘤具有重要意義，DDIT3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)對(duì)形態(tài)學(xué)評(píng)估是有益的補(bǔ)充。

表1 DDIT3 表達(dá)情況在MLP 和其他圓細(xì)胞腫瘤、高分化脂肪肉瘤中的關(guān)系Tab.1 Relationship between DDIT3 expression in myxoid liposarcoma and other round cell tumors,well-differentiated liposarcoma

圖2 黏液樣脂肪肉瘤中DDIT3 表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)（蘇木精復(fù)染）。A，高表達(dá)；B，低表達(dá)；比例尺，20 μmFig.2 Immunohistochemical examination for DDIT3 exoression in myxoid liposarcoma (counterstaining with hematoxylin). A, high expression; B, low expression; scale bar, 20 μm

此外，在20 例高分化脂肪肉瘤伴黏液變性病例中，有13 例呈高表達(dá)，7 例呈低表達(dá)（圖4），DDIT3 在MLP 與高分化脂肪肉瘤伴黏液變性組的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1），提示DDIT3免疫組織化學(xué)檢測(cè)對(duì)于MLP 與高分化脂肪肉瘤伴黏液變性的鑒別診斷的價(jià)值有限，需謹(jǐn)慎解讀免疫組織化學(xué)染色 結(jié)果。

討 論

MLP 是兒童、青少年常見的脂肪肉瘤亞型，常發(fā)生在下肢深部軟組織，可發(fā)生腹腔和骨轉(zhuǎn)移[4]。由于圓細(xì)胞脂肪肉瘤與黏液樣脂肪肉瘤具有相同的分子遺傳學(xué)改變，2013 年WHO 分類中取消了圓細(xì)胞脂肪肉瘤的亞型，將其視為一種高級(jí)別的黏液樣脂肪肉瘤。形態(tài)學(xué)上，MLP 典型表現(xiàn)是黏液樣基質(zhì)背景分布有均勻的梭形或卵圓形原始間葉細(xì)胞，并伴有特征性的樹枝狀毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)，以及有印戒樣脂母細(xì)胞[5]的聚集，部分病例可見原始間葉細(xì)胞呈肺水腫樣結(jié)構(gòu)排列[6]。高級(jí)別MLP 罕見脂母細(xì)胞，瘤細(xì)胞呈圓形，低倍鏡下呈“小藍(lán)圓”細(xì)胞聚集，黏液樣基質(zhì)不明顯，易被誤診為其他圓細(xì)胞腫瘤，圓細(xì)胞成分與轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加及預(yù)后不良相關(guān)。

DNA 損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子3（DDIT3）又稱為GADD153、CHOP、C/EBPζ，是轉(zhuǎn)錄因子C/EBP 家族中的一個(gè)成員[7]。DDIT3 是一種核定位的DNA 轉(zhuǎn)錄因子，位于12 號(hào)染色體q13.2 區(qū)，在誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞分化和凋亡等方面發(fā)揮著重要作用[8]，該蛋白的表達(dá)與脂肪和造血細(xì)胞[7]的增殖、分化有關(guān)。正常FET 基因（FUS、EWSR1、TAF15）編碼RNA 結(jié)合蛋白，參與多種過程，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、剪接、RNA 運(yùn)輸和DNA 修復(fù)[9]。在大多數(shù)MLP 中，發(fā)生t（12；16）（q13；p11）易位[10]，導(dǎo)致FUS 的N 末端活性結(jié)構(gòu)域和DDIT3 整個(gè)編碼序列融合，形成嵌合癌蛋白FUS‐DDIT3[6]，這種嵌合癌蛋白可以通過作用于參與脂肪形成早期和晚期的轉(zhuǎn)錄因子來阻止脂肪細(xì)胞前體分化，阻止正常脂肪生成[11]，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，F(xiàn)US–DDIT3 的兩個(gè)基因相互作用，影響融合蛋白的穩(wěn)定性和表達(dá)水平，約95%的MLP 都存在FUS‐DDIT3 融合癌基因。FUS‐DDIT3通過調(diào)節(jié)miR‐486/CDK4 軸來調(diào)節(jié)脂肪肉瘤細(xì)胞的增殖和凋亡[12]，同時(shí)通過激活SRC/FAK/RHO/ROCK信號(hào)軸增加其侵襲潛能[13]，這些信號(hào)通路成為治療MLP 的重要靶點(diǎn)。此外，在少數(shù)MLP 病例中，存在t（12；22）（q13；q12）易位[10]，形成嵌合癌蛋白EWSR1‐DDIT3。

臨床工作中，大多數(shù)融合基因通過FISH 或RT‐PCR 的方法來鑒定，使用DDIT3 分離探針檢測(cè)脂肪肉瘤中是否存在DDIT3 重排是診斷MLP 的一種敏感性和特異性均較高的方法。但這些方法一次只能檢測(cè)一種先前鑒定的已知的基因融合亞型，費(fèi)用相對(duì)較高，且對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求較高，F(xiàn)ISH 檢測(cè)結(jié)果的判讀需要對(duì)病理醫(yī)師進(jìn)行專門的培訓(xùn)，不利于基層醫(yī)院開展；二代測(cè)序能對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行測(cè)序，具有額外的優(yōu)勢(shì)[14]，可準(zhǔn)確鑒定對(duì)診斷有高度特異性的所有基因融合，但其成本較高并且報(bào)告周期較長(zhǎng)。因此，臨床工作中急需一種簡(jiǎn)便、快速、可靠的方法應(yīng)用于脂肪肉瘤的診斷與鑒別診斷，之前IHC 用于MLP 的診斷一直缺乏特異性較高的抗體，最近的一項(xiàng)研究闡述了一種新的DDIT3 抗體在區(qū)分MLP 與其他黏液樣軟組織腫瘤中的作用[15]，免疫組織化學(xué)檢測(cè)較傳統(tǒng)的FISH 或PCR 檢測(cè)而言，可提供一種更加快速、廉價(jià)且易于推廣的診斷和鑒別診斷方法，幫助無基因檢測(cè)條件的基層醫(yī)院對(duì)脂肪肉瘤進(jìn)行初步診斷，DDIT3 表達(dá)的檢測(cè)和分析有望與形態(tài)學(xué)和現(xiàn)有的分子病理檢測(cè)互補(bǔ)。

由純圓形細(xì)胞構(gòu)成的高級(jí)別MLP，單純依靠形態(tài)學(xué)很難與其他圓細(xì)胞腫瘤區(qū)分開來。本研究結(jié)果顯示MLP 的DDIT3 蛋白表達(dá)水平顯著高于其他圓細(xì)胞腫瘤，可以鑒別黏液樣/圓細(xì)胞脂肪肉瘤和其他圓細(xì)胞腫瘤。使用DDIT3 抗體對(duì)腫瘤進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合組織學(xué)觀察形態(tài)學(xué)特征，病理醫(yī)生能夠?qū)LP 做出初步的診斷。此外，DDIT3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)也可以提供一種簡(jiǎn)便的方法來評(píng)估MLP 的手術(shù)切緣是否受累。因此，DDIT3 免疫組織化學(xué)可以補(bǔ)充單純的形態(tài)學(xué)評(píng)估以及現(xiàn)有的輔助診斷技術(shù)，有助于MLP 的病理診斷。

病理醫(yī)生在鑒別黏液樣脂肪肉瘤與高分化脂肪肉瘤時(shí)，通常依據(jù)形態(tài)學(xué)表現(xiàn)選用不同的FISH 探針進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于高分化脂肪肉瘤，MDM2/CEP12 雙色熒光探針檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)MDM2 基因擴(kuò)增；而DDIT3雙色分離探針檢測(cè)DDIT3 基因重排陽性可證實(shí)黏液樣脂肪肉瘤的診斷。然而在部分高分化脂肪肉瘤的病例中存在廣泛的間質(zhì)黏液變性，這可能導(dǎo)致病理醫(yī)生在鑒別診斷時(shí)選用FISH 探針時(shí)出現(xiàn)偏差。我們?cè)噲D通過DDIT3 免疫組化檢測(cè)在FISH 檢測(cè)前進(jìn)行探針選擇的初步篩選。然而本研究結(jié)果顯示高分化脂肪肉瘤組與實(shí)驗(yàn)組DDIT3 表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能由于高分化脂肪肉瘤的基因特征是MDM2 基因擴(kuò)增，MDM2 基因位于12 號(hào)染色體q15 區(qū)；DDIT3 基因位于12 號(hào)染色體q13.2 區(qū)，與MDM2 的位置非常接近，由于這種位置上的接近性，DDIT3 基因可以在部分高分化脂肪肉瘤病例中發(fā)生擴(kuò)增[16]，DDIT3 基因擴(kuò)增可能可以解釋部分高分化脂肪肉瘤中存在間質(zhì)黏液變性，形成MLP 的形態(tài)特征[17]。一項(xiàng)研究中表明，在去分化脂肪肉瘤中檢測(cè)到DDIT3 及STAT6 蛋白的低表達(dá)，表達(dá)率分別為16%、14%，兩者表達(dá)率相似。去分化脂肪肉瘤的基因特征與高分化脂肪肉瘤相同，亦為MDM2 基因的擴(kuò)增，STAT6 基因位于12 號(hào)染色體q13 區(qū)，STAT6和DDIT3 基因在染色體上相鄰，兩者均與MDM2 基因位置非常接近，這證明DDIT3 蛋白表達(dá)的變異性可能與其基因的位置有關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示在間質(zhì)黏液變性的高分化脂肪肉瘤中DDIT3 蛋白表達(dá)水平較高，可能是由于DDIT3 與MDM2 基因位置彼此相鄰，MDM2 基因擴(kuò)增導(dǎo)致DDIT3 蛋白非特異性表達(dá)。因此，DDIT3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)尚不能很好鑒別黏液樣脂肪肉瘤與伴有黏液變性的高分化脂肪肉瘤。二者的鑒別診斷仍需使用FISH 或RT‐PCR 的方法。

總之，本研究中所有的MLP 病例DDIT3 呈陽性表達(dá)，在其他圓細(xì)胞腫瘤中，DDIT3 僅顯示了有限表達(dá)，這對(duì)于鑒別MLP 尤其是高級(jí)別MLP 和其他圓細(xì)胞腫瘤具有重要意義。DDIT3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)對(duì)形態(tài)學(xué)評(píng)估是有益的補(bǔ)充，可作為MLP 診斷和鑒別診斷的輔助方法。此外，相對(duì)于FISH、PCR 或NGS 檢測(cè)而言，IHC 檢測(cè)以一種更加便捷、容易推廣的方式幫助病理醫(yī)師對(duì)于MLP病理診斷的評(píng)估。然而，本研究結(jié)果顯示DDIT3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)對(duì)于黏液樣脂肪肉瘤與高分化脂肪肉瘤伴黏液變性的鑒別診斷的價(jià)值有限，二者之間的鑒別尚需基因檢測(cè)進(jìn)一步明確。本研究不足之處在于納入實(shí)驗(yàn)的病例仍然有限，未把其他亞型的高分化脂肪肉瘤或去分化脂肪肉瘤納入其中，因此，使用DDIT3 抗體檢測(cè)脂肪肉瘤不同亞型之間的鑒別診斷價(jià)值還有待進(jìn)一步的研究，在臨床實(shí)踐中，DDIT3 免疫組織化學(xué)的結(jié)果應(yīng)綜合形態(tài)學(xué)以及臨床特征謹(jǐn)慎分析。對(duì)于MLP 的病理學(xué)診斷，DDIT3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)取代傳統(tǒng)分子學(xué)檢測(cè)，還需要更多的確認(rèn)性研究。