間充質干細胞及其外泌體治療急性肺損傷的基礎和臨床研究進展

王晨 馮耘 時國朝

臨床重癥患者死亡的主要原因之一是急性肺損傷(acute lung injury，ALI)，其中老年患者(年齡大于60歲)死亡率更高。目前，臨床上急性肺損傷治療方法多為傳統的呼吸支持，不僅費用昂貴，還會嚴重損害患者的生活質量。近年來臨床上一直在治療策略上進行改進，但只能降低該病的死亡率，缺乏有效特異性治療手段[1]。研究表明，細胞治療具有免疫調節能力，抗炎能力等，其中間充質干細胞(MSCs)及其外泌體(MSCs-ev)因能緩解多器官疾病以及病毒引起肺部并發癥而成為治療ALI的備選治療方案。

一、急性肺損傷(ALI)

急性肺損傷(ALI)主要由多發性外傷、失血性休克、嚴重燒傷等直接或間接引起，其中膿毒癥和肺炎引起ALI的風險較高，臨床具體表現為急性呼吸窘迫綜合癥(acuterespira-torydistresssyndrome，ARDS)。目前認為ALI/ARDS的本質為多種炎癥細胞(如巨噬細胞、中性粒細胞、血管內皮細胞等)及其釋放的炎癥介質，細胞因子間接導致肺臟炎癥反應。ALI/ARDS主要病理特征為肺微血管通透性增加，肺泡腔滲出液富含蛋白質，肺水腫等。

ALI/ARDS作為一種臨床疾病，全身炎癥反應(SIRS)與代償性抗炎反應(CARS)失衡導致多器官功能障礙，伴隨較高的死亡率。但ALI/ARDS的復雜病理生理學特點，提供了廣泛的治療靶點。ALI/ARDS的傳統治療方法有抗感染治療、糾正缺氧、藥物治療等。

目前沒有ALI/ARDS的專一性藥物[2-3]，但仍有一些藥物因其特性被列入備選。糖皮質激素通過抑制促炎因子的生成與釋放，改善脫離機械通氣時間，呼吸順應性以及氧合作用；表面活性劑通過維持肺泡開啟與促進氣體交換，改善氧合，縮短機械通氣時間；抗氧化劑通過清除肺組織中多余的氧自由基，改善患者血氧飽和度和氧分壓；非甾體類藥物通過使血小板凝結，發揮抗炎作用，減少肺泡灌洗液中蛋白質，白細胞含量；血管擴張劑通過改善組織供氧，降低肺動脈高壓，改善氧合；除此之外西維來司他鈉被用于ALI治療[1,4-5]。需要注意的是，這些藥物的使用需要考慮病人實際情況。另外根據臨床上潮氣量(VT)、氧合指數(PaO2/FiO2)、呼吸頻率(RR)等參數做出具體的呼吸支持策略，如機械通氣、體外膜肺氧合等。給予呼吸支持，雖然可快速改善患者低氧血癥和高碳酸癥，但仍要考慮呼吸支持帶來的并發癥，如氣胸、肺不張、人-機對抗等。ALI/ARDS的治療，目前尚未有特異有效的治療方法。細胞治療因其多能性和可溶性生物活性因子的釋放等特性被認為是一種潛在的治療手段。

二、間充質干細胞(MSCs)

細胞治療中，MSCs因其多譜系分化能力，調節炎癥的能力，調控免疫的能力而備受關注。

(一)MSCs 基本信息

MSCs作為重要的多能非造血干細胞之一，最早于1968年由弗里登斯坦及其同事在骨髓中提取出來，此后開始對MSCs長達半個世紀的探索，于2006年國際細胞治療學會對間充質干細胞做出具體最小標準：(1)在標準組織培養條件下，該細胞可貼壁生長。(2)在標準組織培養條件下，該細胞可分泌CD105、CD73和CD90等表面標記物，不可分泌CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79和CD19等細胞標記物。(3)在特殊組織培養條件下，該細胞可分化成成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等。

(二)MSCs治療ALI/ARDS的潛能

間充質干細胞自身潛能具有多樣性，因此在急性肺損傷治療過程中的受體細胞也具有多樣性。例如：間充質干細胞在趨化因子的作用下與血管內皮細胞相互作用；間充質干細胞在線粒體、生物活性因子、凋亡基因等作用下與肺泡上皮細胞相互作用，另外間充質干細胞與免疫細胞之間的作用更為復雜。

1 間充質干細胞(MSCs)的遷移和歸巢

MSCs可以在趨化因子的協助下完成遷移與歸巢。間充質干細胞(MSCs)可以分泌趨化因子受體如：CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8等，識別趨化因子，誘導MSCs向炎癥或損傷部位移動,并在粘附分子與受損部位內皮血細胞相互作用使MSCs定向移動，完成歸巢。值得注意的是，肺是間充質干細胞歸巢的主要器官或組織，在多器官損傷的功能障礙發展中，MSCs也會出現在不同的部位。另外，在MSCs治療ALI中，SDF-1/CXCR4軸具有關鍵作用。

2 間充質干細胞(MSCs)的免疫調節能力

MSCs參與免疫調節一般是促進免疫細胞向抗炎表型轉化。首先，MSCs具有低免疫原性：由于間充質干細胞僅表達相容性復合物Ⅰ類分子，可逃避CD4細胞的免疫識別，避免自然殺傷細胞的攻擊[6]。其次，MSCs通過抑制先天或適應性免疫活性實現其免疫調節能力。MSCs通過釋放可溶性因子如TLRs、TGF-β、PGE-2、IL-10實現免疫抑制。另外MSCs在炎癥微環境作用下，使M1型巨噬細胞(促炎)轉變為M2型巨噬細胞(抗炎)，增加吞噬細胞的活性[6]。此外MSCs使Th1細胞的促炎癥反應轉向Th2細胞的抗炎癥反應，分泌可溶性抗炎因子同時抑制促炎因子分泌[7]，如在脂多糖誘導的大鼠模型的ALI中，在間充質干細胞作用下，促炎因子TNF-a、IL-1b和IL-6等表達量降低，抗炎因子IL-10的表達量上升。與傳統的免疫抑制相比，MSCs對免疫系統的影響更為復雜。

另外MSCs還具有抗菌、抗病毒性。MSCs分泌的抗菌肽[8]同時具有抗菌性和抗病毒性。如LL-37對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有抗菌性和抗病毒性，另外，MSCs表達的干擾素刺激基因(LGS)對登革熱病毒、埃博拉病毒等病毒有抗性。

3 間充質干細胞(MSCs)的組織修復與再生

每一個MSCs都具有分化成多個不同組織或器官的潛能。MSCs的組織修復與再生功能是一個復合過程，與MSCs的歸巢與遷移、免疫調節相關。MSCs對肺修復性治療被認為是由一種KGF依賴的旁分泌機制產生的分泌產物發揮作用[9]。在ALI/ARDS發展的同時，MSCs分泌具有大量旁分泌作用的細胞因子(ANG-1、HGF、EGF、KGF)，改變細胞外基質(ECM)的產生和重塑，另外，MSCs可直接分化成肺泡上皮細胞，取代受損細胞[3,10-11]。

4 間充質干細胞(MSCs)線粒體轉移

MSCs線粒體轉移通常借助微囊泡的作用。微囊泡包裹線粒體，從間充質干細胞表面脫落或胞吐作用釋放，微囊泡被肺上皮細胞吞噬后，線粒體轉移進入肺泡上皮細胞，使上皮細胞的ATP的含量升高，從而恢復肺泡上皮細胞生物功能。另外，線粒體轉移至吞噬細胞，可增強吞噬細胞的吞噬活性，增強抗菌性[12]。另有研究查明，線粒體轉移進入受損細胞，可減少由線粒體功能障礙導致的炎癥[13]。

5 其他

ALI/ARDS患者由于肺泡毛細血管屏障被破壞，Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡等原因，使間質肺泡中含蛋白質的水腫液增加。MSCs通過分泌大量生長因子(KGF、HGF、ANG-1)預防和治療肺水腫。另外，MSCs通過遷移和歸巢，進入肺損傷組織，發揮修復作用，改善彌漫性肺水腫。MSCs也可以通過分泌生物活性因子，上調抗凋亡基因，下調抗凋亡基因，以及轉移線粒體的方式減少Ⅱ型肺泡上皮細胞的凋亡[3]。馮耘團隊研究表明脂多糖(LPS)能減少間充質干細胞生物活性因子的分泌，如Ang-1、SPC、FGF-10等，利拉魯肽可通過GLP-1R/PKAc/β-catenin信號通路增強SPC、Ang-1和FGF-10的表達，逆轉脂多糖對間充質干細胞的作用，增加MSCs分泌功能[14]。另有研究表明MSCs可與利拉魯肽協同作用，減少MSCs細胞凋亡。

ALI/ARDS進入第三階段后，肺纖維化迅速發展并致密。肺纖維化主要由ECM蛋白異常表達，過度沉積，使肺組織失去再生功能[15]。MSCs通過分泌可溶性因子MMP-1等阻斷TGF-β/Smad通路，減少纖維化[16]。另外，有研究表明MSCs治療肺纖維化效果更優于抗纖維化藥物[17]。

(三)MSCs治療ALI/ARDS的臨床現狀

1995年，第一次將MSCs應用于臨床試驗中，隨后的一個世紀，探索了MSCs在多種臨床疾病的應用，且已經證明了MSCs的安全性[18]。MSCs治療ALI/ARDS在不同原因導致的肺炎(脂多糖LPB、大腸桿菌等)時，不同給藥方式(靜脈注射、氣管內注射等)及不同劑量產生的治療效果[3]。多個團隊進行了臨床試驗，結果表明MSCs臨床治療ALI/ARDS能改善氧合，并且無不良反應，其中MSCs注射最大劑量為100萬細胞/kg[19-20]。

另有研究表明：(1)骨髓來源的MSCs能通過分泌高抗炎因子IL-10等減少肺部炎癥，降低細菌負荷，減少肺損傷，減弱肺水腫，增強肺上皮創面的修復[3,21-22]。(2)MSCs治療支氣管發育不良[23]，特發性肺纖維化[24]等肺部疾病均安全。(3)盡管MSCs會因為分泌先天促凝活性因子而增加靜脈注射時血栓栓塞的風險，但靜脈注射可能是目前細胞治療急性肺損傷的最優方式[21]。靜脈注射給藥通過參與循化以及自身的歸巢作用，作用于受損器官。

MSCs可以通過減少炎性介質過度表達、白細胞浸潤、組織損傷，已經緩解肺功能衰竭等治療ALI/ARDS，并越來越受關注。但MSCs仍然具有現階段需要解決的問題。首先間充質干細胞在高炎癥等惡劣環境中高度敏感，其次間充質干細胞分泌的某些潛在細胞因子，如VEGF。另外，間充質干細胞在體內的增殖是不受控制的，有成瘤的風險。最后，值得注意的是，MSCs的運用屬于活細胞運用，對MSCs的保存與運輸均有特殊要求[25]。總之，作為治療急性肺損傷的方案之一，MSCs還需要解決間充質干細胞自身穩定性等問題。

三、間充質干細胞外泌體(MSCs-ev)

由于MSCs不可避免的會產生致瘤等風險，MSCs-ev因其低致瘤性，易操作，可用性強等優點，使MSCs-ev治療成為了一種有前途的策略。

(一)基本信息

目前研究表明：MSCs通過分泌可溶性營養因子發揮治療作用，包括細胞因子、趨化因子、生長因子、細胞外囊泡等，這些因子被統稱為分泌組。分泌組產生的途徑一般為經典和非經典途徑。經典途徑指內質網-高爾基體參與的胞吐作用；非經典途徑是信號肽介導的細胞選擇性釋放過程。其中，細胞外囊泡作為磷脂雙分子囊泡，包裹蛋白質，脂質，核酸等生物活性不受影響[21]。因包裹內容物種類與含量決定了細胞外囊泡的功能效應，所以確定胞外囊泡的特征至關重要。

2013年，通過發生過程，大小以及生物學功能等，將胞外囊泡基本分為外泌體、微囊泡、凋亡小體三種[25]，與2018年，國際細胞外囊泡學會召開會議，對胞外囊泡的特征達成共識：1)通過包括蛋白質，脂質或RNA在內的含量分析，分析胞外囊泡的大小；2)通過蛋白質免疫印跡法或PCR技術，分析胞外囊泡的蛋白組成；3)通過可視化技術分析單囊泡分析；4)通過拓撲分析，分析胞外囊泡的相關組件[26]。

(二)間充質干細胞外泌體(MSCs-ev)與間充質干細胞(MSCs)的區別

外泌體(EV)的生物學功能由包裹的蛋白質、mRNA、miRNA決定。MSCs-ev同樣具有調節免疫系統，參與組織修復的作用。另外，EV作為細胞主動向外界分泌的細胞產物，可突破血腦屏障等一類阻礙，在體內循環的作用下，運輸到靶細胞，完成信息傳遞的基本功能。

有研究表明MSCs-ev通過轉移miR-145的方式，調控多藥耐藥相關蛋白MRP1(Multidrug-resistance associated protein 1，MRP1)，增加MRP1 mRNA降解，白三烯B4(leukotriene B4，LTB4)表達水平升高，并通過LTB4/BLT1信號通路增加抗菌活性，并且LTB4與抗菌肽LL-37以協同作用的方式抑制炎癥，增加抗菌。另外miR-145的轉移使抑制基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)降解增加，細胞外LTA4水解酶(LTA4 hydrolase，LTA4H)水平增加，降解PGP促進炎癥消退[27]。除介導微RNA的方式外，MSCs-e在ALI/ARDS中對肺的保護作用中，還具有別的方式。研究表明MSCs-ev能降低核因子κB(NF-κB)與絲裂原活化蛋白激酶(MAKPs)的過度活化，減少巨噬細胞產生促炎因子，依賴TLR4/NF-κB信號通路實現對肺保護。在呼吸機性肺損傷的治療中，MSCs-ev抑制了機械敏感鈣通道(TRPV4)激活，阻止Ca2+內流，減少由高潮氣量通氣引起的肺血管通透性增加和促炎因子對的釋放[28-30]。另研究表明MSCs-ev通過提高肺組織細胞中線粒體自噬水平改善肺血管內皮細胞功能和肺血管內皮通透性。具體機制如下：激活凋亡誘導因子AIF，線粒體自噬相關蛋白Pink1/Parkin蛋白表達增高，肺組織自噬相關蛋白LC3A/B、beclin-1表達升高，炎癥因子TNF-α 表達降低，細胞粘附連接主要成分E-cadherin 蛋白表達升高[31]。還有研究表明MSCs-Exo通過抑制caspase-1的活性抑制肺泡巨噬細胞AMs焦亡減輕ALI。具體機制為：MSCs-Exo抑制caspase-1活性，阻止caspase-1發揮切割作用。AMs焦亡減少，巨噬細胞焦亡相關蛋白表達受抑制，如：NLRP3、GSDMD、IL-1β等，LDH，IL-18炎癥因子水平降低[32]。

相比于完整的細胞相比，MSCs-ev沒有自我復制能力，不會造成醫源性腫瘤。另外，保存方面，間充質干細胞更為苛刻，MSCs-ev可以保存在-80°但不需要二甲基亞砜DMSO的加入，更好的保護MSCs-ev的生物活性。另外，MSCs-ev不含有MHC抗原，異體免疫排斥風險低，提高體內的保存及穩定性。最后，相比于間充質干細胞，MSCs-ev是包裹著miRNA、mRNA、脂質、蛋白質、甚至是細胞器的囊泡，可通過血腦屏障[2]。總之，MSCs-ev因其自身特性，逐漸在被異體移植，再生醫學等領域重視。

(三)MSCs-ev治療ALI/ARDS的臨床現狀

ALI/ARDS總是在臨床上出現多器官功能衰竭癥狀，一般都是由線粒體功能障礙引起[2]，而MSCs-ev可以包裹具有功能活性的線粒體并發生線粒體轉移[2,21]，另外加上MSCs在臨床應用的弊端[33]，使MSCs-ev的研究與應用逐漸走入大眾視線。研究表明：MSCs-ev抑制絲裂原活化蛋白激酶磷酸化，使急性肺損傷小鼠模型的血清中的炎癥因子減少。如IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α等。另外MSCs-ev miR-146a使巨噬細胞由M1型轉化為M2型，從而減輕肺水腫與炎性細胞浸潤。除了急性肺損傷，MSCs-ev還可以對其他肺部疾病有治療效果。如肺動脈高壓、肺癌[34]等。

MSCs-ev治療急性肺損傷的研究大多進行到臨床前試驗動物階段。2020年，在由COVID-19引起的繼發性急性肺損傷中，有24例患者單次靜脈注射間MSCs-ev，患者耐受性良好，MSCs-ev通過下調患者以內細胞因子風暴，參與免疫系統從建改善患者氧合及臨床癥狀[35]。

四、問題與展望

細胞治療作為新興的用于ALI/ARDS的治療手段，想要被臨床認可，除了以上提出的MSCs能調節免疫過程、抗炎、抗病毒、參與組織修復等特性外，還需要解決的問題有：1)MSCs的穩定，包括來源穩定，培養過程穩定、體內定向轉移與增殖穩定。2)MSCs的運輸。除此之外，雖然MSCs治療急性肺損傷的臨床試驗已經進行到Ⅱ期，但仍然無法確認具體劑量。

MSCs屬于異質性細胞，通過分泌活性因子發揮作用，EV為MSCs的分泌組，由其包裹的蛋白質及miRNA的種類及含量決定功能。由此，MSCs-ev用于治療急性肺損傷首先需要解決的就是MSCs-ev標準化問題。另外，MSCs由于提取方式不統一，無法滿足穩定大規模生產。

急性肺損傷的發病率與死亡率一直居高不下，急需尋找一種安全有效的治療方法。細胞治療因可針對性緩解急性肺損傷生理病理學特定，而被納入治療備選。了解MSCs具體的分泌機制有利于臨床試驗對間充質干細胞的應用，另外我們仍需要進一步探索MSCs產生EV的具體機制以及MSCs-ev富集蛋白質與miRNA的機制。這對細胞治療法治療急性肺損傷至關重要。