北京市場(chǎng)飼料原料及全價(jià)飼料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌和3種霉菌毒素情況調(diào)查

陳亞軍，李 芳，王 韞，董 清，袁雪霞，黃 芳

（1.北京市大興區(qū)畜牧水產(chǎn)技術(shù)推廣站，北京 102600；2.北京市通州區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 101101；3.保定職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北保定 071000）

俄羅斯、烏克蘭是全球兩大重要糧食出口國(guó)，出口額占世界市場(chǎng)總量的12%（鐘鈺等，2022）。俄烏對(duì)國(guó)際市場(chǎng)影響嚴(yán)重，我們只能從美國(guó)進(jìn)口飼料原料，但今年美國(guó)出現(xiàn)了嘔吐毒素蔓延的早期跡象。嘔吐毒素（DON）對(duì)人畜健康有很大影響，低劑量攝入會(huì)造成食欲下降、生長(zhǎng)緩慢、發(fā)育不良和病死率升高等現(xiàn)象；大量或長(zhǎng)期攝入會(huì)發(fā)生急性中毒、嘔吐、直腸出血和腹瀉（帕孜來(lái)提·依明，2018）。

了解我國(guó)飼料行業(yè)已經(jīng)出現(xiàn)的霉菌感染變得十分重要，因此，我們檢測(cè)了本基地飼料原料及儲(chǔ)藏期不同的全價(jià)飼料中嘔吐毒素、煙曲霉毒素和玉米赤霉烯酮、蠟樣芽孢桿菌和煙曲霉菌的污染情況。

1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)場(chǎng)內(nèi)所有的飼料原料、外購(gòu)全價(jià)飼料及自制全價(jià)飼料進(jìn)行抽樣，檢測(cè)樣品在高溫高濕的環(huán)境下飼料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌以及嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、煙曲霉毒素的含量。

2 材料

2.1 飼料樣品 飼料原料：采集麥麩、豆粕、仔豬預(yù)混料、玉米、中豬預(yù)混料、乳豬濃縮料、仔豬用枯草芽孢桿菌、中豬用畜禽生物復(fù)合預(yù)混料-活力素、中豬用枯草芽孢桿菌飼料原料共9種，每種2個(gè)重復(fù)，共計(jì)18個(gè)。

自制全價(jià)料：哺乳仔豬料、斷奶仔豬料和育肥豬料，從制成后第0、5、10、15天，采集2個(gè)樣品，共計(jì)24個(gè)。

外購(gòu)全價(jià)料：妊娠母豬料、哺乳母豬料、育肥豬飼料，從進(jìn)入豬舍后第0、5、10、15天，采集2個(gè)樣品，共計(jì)24個(gè)。

2.2 試劑與試劑盒 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MYP培養(yǎng)基、沙堡羅培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。嘔吐毒素（DON）ELISA檢測(cè)試劑盒、玉米赤霉烯酮（ZEN）ELISA檢測(cè)試劑盒和煙曲霉毒素（FB）ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自濱州綠都生物技術(shù)有限公司。

3 方法

3.1 飼料原料和全價(jià)料樣品的采集 按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)采集樣品，用密封袋封口標(biāo)記后低溫迅速送往實(shí)驗(yàn)室，放入4℃的冰箱保存。

3.2 蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌分離和培養(yǎng) 蠟樣芽孢桿菌計(jì)數(shù)：取25 g樣品，用磷酸鹽緩沖液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯 度 稀 釋，按GB/T4789.2-2010要求，取每個(gè)梯度0.1 mL樣品稀釋液加入培養(yǎng)皿中，加入50～60℃未凝固MYP培養(yǎng)基。凝固后，將培養(yǎng)皿置37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～24 h。將可疑菌落進(jìn)行菌落形成單位計(jì)數(shù)。蠟樣芽孢桿菌在此培養(yǎng)基上菌落為粉紅色，挑取可疑菌落5個(gè)做鑒定試驗(yàn)，根據(jù)證實(shí)的蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)計(jì)算該平板上的菌落數(shù)。

煙曲霉菌培養(yǎng)和計(jì)數(shù)：按照GB4789.15-2010方 法，采 用PDA培 養(yǎng) 基，按1∶10，1∶102，1∶103，1∶104，1∶105梯度，各吸取1 mL菌液加入滅菌的PDA平板中，每個(gè)稀釋度做2個(gè)重復(fù)，置于27～29℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后計(jì)數(shù)。

3.3 毒素含量檢測(cè) 按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)嘔吐毒素、煙曲霉毒素、玉米赤霉烯酮的含量。以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以DON標(biāo)準(zhǔn)品濃度的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，計(jì)算樣本中DON的實(shí)際濃度。

4 結(jié)果

4.1 飼料原料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌及3種霉菌毒素含量檢測(cè) 9種飼料原料中，蠟樣芽孢桿菌檢出率100%，其中乳豬濃縮料超過(guò)國(guó)家細(xì)菌允許量標(biāo)準(zhǔn)（國(guó)標(biāo)（G13078-2017））。煙曲霉菌的檢出率100%，中豬預(yù)混料超過(guò)國(guó)家霉菌允許量（國(guó)標(biāo)（G13078-2017））。ZEN檢出率33.3%，超標(biāo)率22.2%；DON檢出率88.9%，超標(biāo)率22.2%；FB檢出率88.9%，但不超標(biāo)。其中玉米和中豬用枯草芽孢桿菌ZEN檢出值較高，玉米、仔豬用枯草芽孢桿菌和中豬用枯草芽孢桿菌DON檢出值較高；中豬預(yù)混料、乳豬濃縮料、仔豬用枯草芽孢桿菌FB檢出值最高；麥麩、豆粕、仔豬預(yù)混料、中豬預(yù)混料、乳豬濃縮料中ZEN檢出值為0，仔豬預(yù)混料中DON檢出值為0，玉米中FB檢出值為0；仔豬預(yù)混料中3種霉菌毒素的檢出率都比較低。

表1 飼料原料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌及3種霉菌毒素含量

4.2 全價(jià)料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌及3種霉菌毒素含量 將自制仔豬全價(jià)料、自制中豬全價(jià)料、自制乳豬全價(jià)料、外購(gòu)中豬全價(jià)料、外購(gòu)妊娠乳豬全價(jià)料、外購(gòu)哺乳母豬全價(jià)料室溫（溫度25～27℃，濕度60%～70%）條件下儲(chǔ)存，第0、5、10、15天進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以確定不同生長(zhǎng)階段豬只飼料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌、DON、FB和ZEN的污染特點(diǎn)及其規(guī)律。

4.2.1 自制仔豬全價(jià)料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌數(shù)量及DON、FB和ZEN含量 隨著儲(chǔ)存時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，自制仔豬全價(jià)料中蠟樣芽孢桿菌檢出量呈上升趨勢(shì)。整個(gè)儲(chǔ)藏過(guò)程中均能檢測(cè)到較高水平的煙曲霉菌污染，第10天開始呈下降趨勢(shì)。

隨著儲(chǔ)存天數(shù)的不斷增加，ZEN檢出量逐漸升高，DON檢出量呈上升趨勢(shì)，F(xiàn)B檢出量一直維持在較高水平，受儲(chǔ)存天數(shù)的影響不大。但所有霉菌和毒素含量均低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

4.2.2 自制中豬全價(jià)料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌數(shù)量及DON、FB和ZEN含量 儲(chǔ)藏前期（0～10 d），樣品中蠟樣芽孢桿菌的檢出量呈上升趨勢(shì)，第15天的檢測(cè)量有所下降，但仍維持在較高水平。煙曲霉菌、DON、FB均在第5天檢出量最高，隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。ZEN含量先緩慢上升，在第10天陡然上升，并維持在較高水平。

表2 全價(jià)料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌數(shù)量及DON、FB和ZEN含量

4.2.3 外購(gòu)中豬全價(jià)料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌數(shù)量及DON、FB和ZEN含量 除第15天，外購(gòu)中豬全價(jià)料均未檢出蠟樣芽孢桿菌和煙曲霉菌污染，檢出量分別為3×103和4×102。第10天檢出ZEN；僅在第0天檢出FB；DON含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在第15天略有上升。

4.2.4 自制乳豬全價(jià)料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌數(shù)量及DON、FB和ZEN含量 自制乳豬全價(jià)第10和15天檢出蠟樣芽孢桿菌污染，檢出量分別為4×104、5.8×104。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中，煙曲霉菌載量均維持在較高水平。ZEN含量雖呈下降趨勢(shì)，但檢測(cè)時(shí)間內(nèi)的含量均超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；DON含量相對(duì)檢出量也較高，在第10天達(dá)到檢測(cè)峰值；FB含量第0天檢出量為0，第15天檢測(cè)值突然攀升達(dá)到最高值。

4.2.5 外購(gòu)妊娠母豬全價(jià)料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌數(shù)量及DON、FB和ZEN含量 外購(gòu)妊娠母豬全價(jià)料重蠟樣芽孢桿菌的污染持續(xù)存在，且在第5天達(dá)到峰值。僅第15天檢出1×102的煙曲霉菌。DON和FB含量在第0、5天均未檢出，ZEN在第10天檢出值達(dá)到最高值并超標(biāo)，F(xiàn)B的檢出量仍然維持在較低水平；DON含量在第0、5天基本相同，在第10天出現(xiàn)檢測(cè)峰值。

4.2.6 外購(gòu)哺乳母豬全價(jià)料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌數(shù)量及DON、FB和ZEN含量 樣品中蠟樣芽孢桿菌的檢出量有上升趨勢(shì)，第5、10天的檢出量分別為2×102、1.1×102，第15天出現(xiàn)檢出峰值，檢出量為3.4×102；未發(fā)現(xiàn)煙曲霉菌污染。DON、ZEN和FB均在第10天出現(xiàn)檢測(cè)峰值。

4.3 蠟樣芽孢桿菌及DON、FB和ZEN的檢出率 由表3可知，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，不同生長(zhǎng)階段的豬飼料中蠟樣芽孢桿菌的檢出量均有所升高，但煙曲霉菌的檢出量呈現(xiàn)出較為明顯的下降趨勢(shì)。而且3種毒素動(dòng)態(tài)檢測(cè)結(jié)果顯示，自制飼料中污染DON、FB和ZEN的程度均高于外購(gòu)成品飼料，同時(shí)較高的檢出量也可提示DON、FB和ZEN污染嚴(yán)重。

表3 蠟樣芽孢桿菌及DON、FB和ZEN的檢出率 %

5 討論

目前我國(guó)養(yǎng)殖行業(yè)對(duì)霉菌毒素的危害意識(shí)不夠，沒(méi)有進(jìn)行污染物含量的檢測(cè)，而且我國(guó)只有部分配合飼料（如豬、禽及犢牛飼料嘔吐毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)），未制定飼料原料（除DDGS外）中嘔吐毒素限量標(biāo)準(zhǔn)（崔華等，2020）。被污染的飼料中氨基酸含量會(huì)受到影響，從而降低了飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值（閆珊珊等，2020）。而且嘔吐毒素等多種毒素疊加增加了毒素的細(xì)胞毒性，可引發(fā)豬胃潰瘍的慢性疾病（王曉敏等，2021）。

王新（2019）用酶聯(lián)免疫法對(duì)2016～2018年河北、內(nèi)蒙古等6省飼料嘔吐毒素污染情況進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果顯示，我國(guó)玉米中嘔吐毒素污染處于中等污染程度，這表明華北地區(qū)的飼料被污染情況十分嚴(yán)重。徐詠寧等（2020）研究表明，夏秋季節(jié)高溫高濕環(huán)境易于蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌等的滋生，因此，儲(chǔ)存過(guò)程中應(yīng)注意環(huán)境控制。

6 結(jié)論

綜上所述，華北地區(qū)的飼料被真菌及毒素嚴(yán)重污染，應(yīng)盡快制定飼料原料毒素污染限量，從而保證養(yǎng)殖業(yè)的正常發(fā)展。