超聲輔助纖維素酶法優(yōu)化紅小豆蛋白提取工藝研究

張春華，翟愛華

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶 163319；2.綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江 綏化 152061）

紅小豆具有高蛋白、低脂肪、多營養(yǎng)的特點(diǎn)[1]，其含有的多種生物活性物質(zhì)，如多酚、黃酮等成分，具有抗氧化、降血糖、提高免疫力、抗癌等功效，紅小豆是一種藥食同源雜糧[2]。紅小豆內(nèi)含人類機(jī)體必需的8類氨基酸，含量最大的是賴氨酸（Lys）與谷氨酸（Glu）[3]，為植物蛋白的優(yōu)質(zhì)供體。紅小豆中的蛋白含量為20.92%～24.00%，高于肉類、雞蛋、牛奶和禾谷類食物[4]。豆類分離蛋白除了營養(yǎng)價(jià)值高、易吸收外，還具有良好的功能性，可以添加到各種食品中[5-7]。提取豆類分離蛋白方面，酶解法、堿溶酸沉法、超濾膜法與超聲波輔助法等的應(yīng)用率很高[8-11]，各具優(yōu)劣勢。

超聲波和纖維素酶處理可以分解和破壞植物細(xì)胞壁纖維結(jié)構(gòu)，使原料中的蛋白質(zhì)溶出，以提高蛋白質(zhì)的提取率。具諸多優(yōu)勢，包括反應(yīng)條件溫和、高提取率、低成本、提取時(shí)間少等[12-14]。現(xiàn)多采用多種方法結(jié)合，提高提取效率。通過利用超聲輔助纖維素酶的方法建立了一種紅小豆蛋白質(zhì)的提取方法。此法可使紅小豆蛋白質(zhì)得率顯著提升，改善提取技術(shù)，為后續(xù)開發(fā)應(yīng)用紅小豆蛋白質(zhì)打下良好基礎(chǔ)，在理論上給予借鑒。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

紅小豆，種子公司出售。

1.2 試驗(yàn)主要儀器和設(shè)備

FA2104型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器公司產(chǎn)品；DFY-500型高速搖擺式超微粉碎機(jī)，溫山市林大機(jī)械有限公司產(chǎn)品；SH10A型可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；PHS-25型數(shù)顯酸度計(jì)，上海偉業(yè)儀器廠產(chǎn)品；Scientz-IID型細(xì)胞超聲破碎儀，寧波新芝公司產(chǎn)品；PS-08A型超聲波清洗機(jī)，東莞市潔康超聲波設(shè)備公司產(chǎn)品；TGL-16B型臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南星科科學(xué)儀器公司產(chǎn)品；DW-86L型超低溫保存箱，青島海爾股份有限公司產(chǎn)品；FD-27型冷凍干燥機(jī)，北京德天佑科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；K9840型自動(dòng)定氮儀，濟(jì)南海能儀器有限公司產(chǎn)品；HYP-1004型消化爐，上海纖檢儀器有限公司產(chǎn)品；BGZ-30型電熱鼓風(fēng)干燥器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；SRJX-4-9型箱式電阻爐，江蘇東臺(tái)縣電器廠產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)條件和方法

2.1 紅小豆常規(guī)成分分析

2.1.1 蛋白質(zhì)含量

參照GB 5009.5—2016測定。

2.1.2水分含量

參照GB 5009.3—2016測定。

2.1.3脂肪含量

參照GB 5009.6—2016測定。

2.1.4灰分含量

參照GB 5009.4—2016測定。

2.1.5上清液中蛋白質(zhì)含量的測定

參照考馬斯亮藍(lán)法[15]。

2.2 工藝流程

首先，利用纖維素酶（50 U/mg）水解紅小豆粉，破壞植物細(xì)胞壁纖維結(jié)構(gòu)，以增加堿溶酸沉法提取時(shí)蛋白質(zhì)的溶出率。隨后進(jìn)行超聲波處理，再利用堿溶酸沉法提取，可大大提高蛋白質(zhì)的提取率。

其工藝流程如下：

紅小豆→清洗浸泡去皮→冷凍干燥→粉碎過篩→石油醚脫脂→脫脂紅小豆粉→加纖維素酶處理→超聲處理→堿溶酸沉法提取→離心分離→收集上清液→調(diào)節(jié)pH值至等電點(diǎn)→離心分離→取沉淀物→反復(fù)水洗離心→真空冷凍干燥→紅小豆蛋白質(zhì)。

2.3 紅小豆蛋白提取率

計(jì)算公式如下：

式中：M提取——提取出紅小豆蛋白的質(zhì)量，即上清液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g；

M原料——脫脂紅小豆粉的質(zhì)量，g；

C總蛋白含量——單位質(zhì)量紅小豆中蛋白質(zhì)的含量，%。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 超聲物料濃度選擇試驗(yàn)

當(dāng)超聲時(shí)間、超聲功率、超聲溫度與酸堿度依次為20 min，400 W，35℃，9.0時(shí)，分析不同料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30）對(duì)紅小豆分離蛋白質(zhì)得率的影響。

2.4.2 超聲功率選擇試驗(yàn)

當(dāng)超聲時(shí)間、超聲溫度、料液比、酸堿度依次為20 min，35℃，1∶25，9.0時(shí)，分析不同超聲功率（100，200，300，400，500 W）對(duì)紅小豆蛋白質(zhì)得率狀況的影響。

2.4.3 超聲時(shí)間選擇試驗(yàn)

當(dāng)超聲溫度、超聲功率、料液比與酸堿度依次為35℃，400 W，1∶25，9.0時(shí)，分析不同超聲時(shí)間（10，15，20，25，30 min）對(duì)紅小豆蛋白質(zhì)得率的影響。

2.4.4 纖維素酶酶解時(shí)間試驗(yàn)

固定加酶量250 U/g，pH值4.8，酶解溫度30℃，料液比1∶25，分析不同酶解時(shí)間（20，25，30，35，40 min）對(duì)紅小豆蛋白得率狀況的影響。

2.4.5 纖維素酶酶解pH值試驗(yàn)

固定加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度與料液比依次為250 U/g，35 min，30℃，1∶25，分別在pH值為4.0，4.4，4.8，5.2，5.6的條件下，分析對(duì)紅小豆蛋白提取率的影響。

2.4.6 酶解溫度試驗(yàn)

固定加酶量250 U/g，pH值4.8，酶解時(shí)間35 min，料液比1∶25，分別考查在酶解溫度為25，30，35，40，45℃的條件下對(duì)紅小豆蛋白提取率的影響。

2.4.7 加酶量選擇試驗(yàn)

固定料液比1∶25，調(diào)節(jié)pH值至4.8，分別按照100，150，200，250，300 U/g的加酶量加入纖維素酶，置于水浴鍋中于30℃溫度條件下進(jìn)行酶解35 min，考查對(duì)紅小豆蛋白提取率的影響。

2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采取單因素試驗(yàn)，將纖維素酶酶解溫度、酶解時(shí)間與pH值依次固定為30℃，35 min，4.8，考查指標(biāo)為提取率，對(duì)紅小豆蛋白提取效果有顯著影響的主要因素超聲功率、超聲時(shí)間、料液比、纖維素酶用量進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。

正交設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)

3 結(jié)果與分析

3.1 脫脂紅小豆粉主要成分

脫脂紅小豆粉主要成分含量見表2。

表2 脫脂紅小豆粉主要成分含量/%

3.2 紅小豆蛋白提取影響的因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 料液比對(duì)紅小豆蛋白質(zhì)提取率的影響

料液比對(duì)紅小豆蛋白提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對(duì)紅小豆蛋白提取率的影響

由圖1可知，料液比同蛋白質(zhì)得率間的關(guān)系，料液比初始為1∶10，隨著料液比的提高，紅小豆蛋白得率先逐漸提高；當(dāng)料液比為1∶25時(shí)，得率達(dá)峰值；當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，得率大幅降低。這表明適宜的料液比可以促使蛋白質(zhì)溶出，再增大料液比，溶液濃度降低，溶質(zhì)減少，提取率隨之下降[12]。因此，在此試驗(yàn)條件下料液比為1∶25最好。

3.2.2 超聲功率對(duì)紅小豆蛋白質(zhì)提取率的影響

超聲功率對(duì)紅小豆蛋白提取率的影響見圖2。

圖2 超聲功率對(duì)紅小豆蛋白提取率的影響

由圖2可知，在超聲功率逐漸增大時(shí)，紅小豆蛋白得率呈先提高再下降的表現(xiàn)，功率為400 W時(shí)，提取率達(dá)最大值，這可能是由于超聲破碎紅小豆的細(xì)胞壁使其細(xì)胞中的蛋白溶出，提高了蛋白的得率，然而在超聲功率〉400 W時(shí)，超聲會(huì)破壞蛋白質(zhì)的溶出，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，使得蛋白質(zhì)得率下降[14]。

3.2.3 超聲時(shí)間對(duì)紅小豆蛋白質(zhì)提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)紅小豆蛋白提取率的影響見圖3。

由圖3可知，當(dāng)超聲時(shí)間處于10～25 min水平，隨紅小豆蛋白質(zhì)得率增加呈上升表現(xiàn)，當(dāng)超聲時(shí)間為25 min時(shí)，蛋白質(zhì)得率達(dá)峰值；但超聲時(shí)間〉25 min時(shí)，紅小豆蛋白得率在超聲時(shí)間提高的同時(shí)稍見下降，這是因?yàn)槌晻r(shí)間過長，破碎已溶出的蛋白，同時(shí)超聲時(shí)間過長產(chǎn)生熱量對(duì)蛋白具有破壞作用，所以提取率反而下降[14]。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)紅小豆蛋白提取率的影響

3.2.4 酶解時(shí)間對(duì)紅小豆蛋白質(zhì)提取率的影響

纖維素酶酶解時(shí)間對(duì)紅小豆蛋白提取率的影響見圖4。

圖4 纖維素酶酶解時(shí)間對(duì)紅小豆蛋白提取率的影響

由圖4可知，酶解時(shí)間在35 min時(shí)，紅小豆蛋白提取率達(dá)到最高，隨后呈現(xiàn)下降的趨勢。這是由于隨著酶解時(shí)間增加，纖維素酶進(jìn)一步對(duì)破碎后的紅小豆細(xì)胞壁進(jìn)行水解，蛋白質(zhì)溶出，提取率升高；隨時(shí)間增加，蛋白質(zhì)變性，凝集沉淀，提取率降低[13]。

3.2.5 酶解pH值對(duì)紅小豆蛋白質(zhì)提取率的影響

酶解pH值對(duì)紅小豆蛋白質(zhì)提取率的影響見圖5。

圖5 酶解p H值對(duì)紅小豆蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖5可知，不同的酶解pH值對(duì)紅小豆蛋白提取率不同，當(dāng)pH值4.4時(shí)，紅小豆蛋白提取率最低，因?yàn)樵損H值位于紅小豆蛋白等電點(diǎn)附近，蛋白凝集沉淀，提取率最低；pH值4.8時(shí)，蛋白提取率最高，此時(shí)纖維素酶活性最大，蛋白質(zhì)-水相互作用增強(qiáng)，溶解性提高；隨pH值增大，纖維素酶活性降低，提取率降低[14]。

3.2.6 酶解溫度對(duì)紅小豆蛋白提取率的影響

酶解溫度對(duì)紅小豆蛋白質(zhì)提取率的影響見圖6。

由圖6可知，酶解溫度可影響紅小豆蛋白得率，在酶解溫度上調(diào)至30℃時(shí)，得率最高，隨著溫度繼續(xù)提高，得率反而降低，原因在于溫度過高會(huì)減弱纖維素酶活力，使得酶解不徹底，同時(shí)在受熱情況下，紅小豆蛋白會(huì)發(fā)生分解，降低蛋白質(zhì)得率[13]。

圖6 酶解溫度對(duì)紅小豆蛋白質(zhì)提取率的影響

3.2.7 纖維素酶用量對(duì)紅小豆蛋白質(zhì)提取率的影響

纖維素酶用量對(duì)紅小豆蛋白提取率的影響見圖7。

圖7 纖維素酶用量對(duì)紅小豆蛋白提取率的影響

由圖7可知，在酶用量處于一定范圍時(shí)，紅小豆蛋白得率正向相關(guān)于酶用量，在酶用量為250 U/g時(shí)，可實(shí)現(xiàn)最大得率，隨著酶用量增加，得率稍見下降。可見，酶用量在250 U/g以下時(shí)，酶量少，底物沒有充足的酶作用，這時(shí)增加酶用量可以使底物與酶解反應(yīng)充足和完全，隨著酶用量繼續(xù)增加，底物被酶飽和，不會(huì)出現(xiàn)明顯的酶解變化，且總固形物含量上升，同時(shí)纖維素酶擴(kuò)散作用降低，蛋白質(zhì)提取率也變化不大[13]。因此，單因素試驗(yàn)確定最佳酶用量為250 U/g。

3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)方案和試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表4 方差分析

通過表3所示R值能夠發(fā)現(xiàn)，影響紅小豆蛋白質(zhì)得率最大的因素是料液比，其次為超聲功率，纖維素酶用量次之，超聲時(shí)間相對(duì)最弱，提取的最優(yōu)工藝為料液比1∶25（g∶mL），超聲功率400 W，纖維素酶用量250 U/g，超聲時(shí)間30 min。根據(jù)最優(yōu)組合A2B2C3D2，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此工藝下能夠?qū)崿F(xiàn)75.38%的紅小豆分離蛋白得率，與正交試驗(yàn)所示各處理得率相比皆偏高，可見所得優(yōu)化水平具可靠性。

表3 正交試驗(yàn)方案和試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

超聲輔助纖維素酶法技術(shù)對(duì)紅小豆蛋白的提取有顯著提高，可以大大增加蛋白質(zhì)的提取率，在纖維素酶用量250 U/g，料液比1∶25（g∶mL），超聲功率400 W，超聲時(shí)間30 min，實(shí)際提取率75.38%。比傳統(tǒng)的堿溶酸沉法節(jié)省了提取時(shí)間，降低了成本，優(yōu)化了紅小豆蛋白提取工藝，為下一步紅小豆蛋白質(zhì)的開發(fā)利用奠定了良好的基礎(chǔ)，提供了理論指導(dǎo)。