食品中菌落總數(shù)檢測能力驗(yàn)證的結(jié)果分析與質(zhì)量控制

李文綺，谷天雨，李自芹

（1.石河子質(zhì)量與計(jì)量檢測所，新疆 石河子 832000；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)質(zhì)量技術(shù)評價(jià)中心，新疆 烏魯木齊 830000；3.新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆 石河子 832000）

能力驗(yàn)證是考核實(shí)驗(yàn)室檢測能力的有效手段，通常預(yù)先制定好相應(yīng)的計(jì)劃和實(shí)施方案，利用試驗(yàn)室間比對或者測量審核，以評價(jià)各參加者的能力[1-2]。

菌落總數(shù)（Aerobic plate count），是指待檢樣品經(jīng)過一定的處理（通常是采用無菌磷酸鹽緩沖液或無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋），在特定的環(huán)境條件中進(jìn)行培養(yǎng)后，1 g或1 mL樣品中形成的細(xì)菌菌落總數(shù)量[3]，是一個(gè)統(tǒng)稱，包含各種各樣的細(xì)菌。當(dāng)食品中的細(xì)菌超標(biāo)，就會(huì)危害人體的健康，因此在食品檢驗(yàn)中，菌落總數(shù)通常是非常重要的微生物指標(biāo)，其準(zhǔn)確測定和計(jì)數(shù)對把控食品安全質(zhì)量具有重要的意義。于2020年和2021年參加由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測試評價(jià)中心組織的食品中菌落總數(shù)的檢測能力驗(yàn)證，現(xiàn)將連續(xù)2年的試驗(yàn)操作和結(jié)果及由此獲得的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)分享如下。

1 材料與方法

1.1 測試樣品

能力驗(yàn)證測試樣品見表1。

表1 能力驗(yàn)證測試樣品

1.2 儀器與試劑

JE3002型電子天平（0.01 g），上海浦春計(jì)量儀器有限公司產(chǎn)品；YXQ-LS-50SⅡ型和YXQ-LS-70A型立式壓力蒸汽滅菌器2臺(tái)、BSC-1300ⅡA-B3型生物安全柜、BSP-150型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；DZKW-D-6型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品；Talboys型旋渦混合器，美國公司產(chǎn)品；PHS-3C型酸度計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品。

0.85%的無菌生理鹽水（氯化鈉AR），天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司提供；平板計(jì)數(shù)瓊脂（BR），北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.3 檢驗(yàn)方法

依據(jù)GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》[3]和測試樣附帶的參試指導(dǎo)書（ACAS-PT917（2020）乳粉中菌落總數(shù)的檢測能力驗(yàn)證參試指導(dǎo)書、ACAS-PT1081（2021）食品中菌落總數(shù)的檢測能力驗(yàn)證參試指導(dǎo)書）的要求進(jìn)行檢測。

1.4 檢驗(yàn)步驟

1.4.1 樣品接受與制備

（1）樣品接受。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)隨時(shí)關(guān)注能力驗(yàn)證樣品寄送情況，及時(shí)接受。接到樣品后，建議立即進(jìn)行檢驗(yàn)。如不能立即檢測，應(yīng)嚴(yán)格按照參試指導(dǎo)書的要求先行保存（2020年乳粉樣品要求的保存溫度2～6℃，2021年食品樣品要求的保存溫度2～8℃），防止樣品中原有微生物的狀況發(fā)生變化[4]。

（2）樣品制備。能力驗(yàn)證的樣品一般包裝于真空西林瓶內(nèi)，應(yīng)小心開啟。開啟后，立即加入5 mL稀釋液（0.85%的無菌生理鹽水）進(jìn)行再水化，待凍干樣品充分溶解后，用無菌移液管吸出放入無菌瓶中，再反復(fù)多次用稀釋液清洗西林瓶內(nèi)壁和瓶蓋，稀釋液一并轉(zhuǎn)入無菌瓶中，確保瓶內(nèi)待測樣品盡可能被全部轉(zhuǎn)入?yún)⒃囍笇?dǎo)書指定體積的稀釋液中（文中2次能力驗(yàn)證均為60 mL）。最終的混合液即為待測樣品原液，將該樣品原液置于旋渦混合器上充分混勻待用（從冰箱中取出的樣品應(yīng)先恢復(fù)至室溫再進(jìn)行上述操作）。

1.4.2 樣品稀釋

用滅菌的移液管吸取上述樣品原液25 mL置于0.85%滅菌生理鹽水225 mL中，旋渦混勻，制成10-1的樣品勻液，再吸取10-1的樣品勻液1 mL，加入到9 mL滅菌生理鹽水中（移液管切勿觸碰稀釋液面），旋渦混勻。重復(fù)上述操作，逐級稀釋成10倍系列梯度的樣品勻液（每遞增稀釋1次，都要更換無菌移液管）?？紤]到能力驗(yàn)證樣品的復(fù)雜性，2次試驗(yàn)均設(shè)置9個(gè)梯度，即原液、10-1～10-8。

1.4.3 樣品取樣及培養(yǎng)

各稀釋梯度（包括樣品原液）各取1 mL樣液加入到90 mm無菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度至少接2個(gè)平皿，操作時(shí)間允許的話可接4個(gè)平皿。同時(shí)，做3組空白對照（無菌室環(huán)境監(jiān)測、生理鹽水空白對照、平板計(jì)數(shù)瓊脂空白對照）各2個(gè)平皿。加好樣液后，及時(shí)將置于46℃（溫度過高會(huì)影響細(xì)菌生長，過低瓊脂易凝固）恒溫水浴鍋的瓊脂培養(yǎng)基取18～20 mL傾注到90 mm的平皿中[5]，并順時(shí)針、逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使樣液和培養(yǎng)基充分混勻，待瓊脂凝固后再覆蓋一層約4 mL培養(yǎng)基（防止菌落蔓延、造成計(jì)數(shù)不準(zhǔn)）。待完全凝固后，將培養(yǎng)皿倒置于36±1℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.4.4 菌落計(jì)數(shù)

當(dāng)平板上菌落大量生長時(shí)即可進(jìn)行觀察，選擇典型的菌落計(jì)數(shù)。菌落數(shù)小于300 CFU的平板均應(yīng)記錄具體的數(shù)量，大于300 CFU的可不記詳細(xì)的數(shù)量，以多不可計(jì)表示。每個(gè)稀釋度的菌落在計(jì)數(shù)時(shí)，綜合考慮其他稀釋梯度的菌落數(shù)，菌落生長的個(gè)數(shù)應(yīng)與稀釋度大小呈反比，理論上每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)接近10倍的關(guān)系，若不符合上述規(guī)律，且差異比較大，在計(jì)算時(shí)，應(yīng)剔除異常的平板，采用其他稀釋度的2個(gè)平板平均計(jì)數(shù)。詳細(xì)的計(jì)數(shù)規(guī)則參見GB 4789.2的要求[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品檢測結(jié)果分析

2020年的乳粉樣品，2個(gè)測試樣可計(jì)數(shù)的稀釋梯度為10-1，10-2，10-3，只有稀釋梯度10-1，10-2的平皿，菌落數(shù)在30～300 CFU，故選擇這2個(gè)稀釋度的平皿菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

2021年的食品樣品，21-A211樣可計(jì)數(shù)的稀釋梯度為10-2，10-3，10-4；21-D656樣可計(jì)數(shù)的稀釋梯度為10-3，10-4。同樣，選取菌落數(shù)在30～300 CFU的平板計(jì)數(shù)，則21-A211樣以稀釋梯度10-2的平皿，21-D656樣以稀釋梯度10-3的平皿菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

連續(xù)2年的樣品菌落總數(shù)檢測結(jié)果見表2。

表2 連續(xù)2年的樣品菌落總數(shù)檢測結(jié)果

2.2 能力驗(yàn)證結(jié)果分析

能力驗(yàn)證的結(jié)果通常采用Z值（由能力驗(yàn)證的指定值和能力評定標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算實(shí)驗(yàn)室偏倚的標(biāo)準(zhǔn)化度量[6）]進(jìn)行評價(jià)。當(dāng)時(shí)，表示檢測結(jié)果滿意；時(shí)，表示檢測結(jié)果可疑；時(shí)，表示檢測結(jié)果不滿意。

菌落總數(shù)的檢測能力評價(jià)結(jié)果見表3。

表3 菌落總數(shù)的檢測能力評價(jià)結(jié)果

2.3 菌落總數(shù)檢測的影響因素和質(zhì)量控制分析

2020年的2個(gè)樣品的檢測結(jié)果均偏小，經(jīng)過分析，主要存在以下幾個(gè)方面的原因：①倒平板時(shí)未進(jìn)行覆蓋，菌落生長過程中出現(xiàn)蔓延，計(jì)數(shù)時(shí)存在較大的誤差。②計(jì)數(shù)時(shí)對蔓延的菌落計(jì)數(shù)不規(guī)范，造成數(shù)值偏小。③對標(biāo)準(zhǔn)理解不透。雖然選取了菌落數(shù)在30～300 CFU范圍的平板，但是疏忽了一個(gè)重要的附加條件——無蔓延菌落生長，導(dǎo)致計(jì)算公式選用錯(cuò)誤，結(jié)果偏低。在對能力驗(yàn)證不滿意結(jié)果認(rèn)真分析之后，再次申報(bào)了2021年該項(xiàng)目的能力驗(yàn)證，并取得了滿意的結(jié)果。

微生物能力驗(yàn)證一般不指定方法，要求各實(shí)驗(yàn)室優(yōu)先選擇常用的檢測方法。

測試樣品不同于平時(shí)的檢驗(yàn)樣品，具有復(fù)雜性。因此在具體的操作過程中每一個(gè)環(huán)節(jié)都要考慮到，尤其是微生物能力驗(yàn)證樣品，其微生物多樣的特性決定了很難進(jìn)行多次重復(fù)試驗(yàn)，基本都是一次試驗(yàn)報(bào)送結(jié)果，這就要求從檢驗(yàn)準(zhǔn)備到試驗(yàn)結(jié)束的每一個(gè)環(huán)節(jié)都不能疏忽。嚴(yán)格按照國標(biāo)方法及能力驗(yàn)證參試指導(dǎo)書的要求操作至關(guān)重要，同時(shí)要對試驗(yàn)過程每個(gè)可能存在的風(fēng)險(xiǎn)因素進(jìn)行把控。

2.3.1 人員的控制

能力驗(yàn)證的操作人員一定是實(shí)驗(yàn)室檢測該項(xiàng)目的人員，要求具備相應(yīng)的微生物學(xué)知識(shí)，具有一定的操作能力，熟練掌握授權(quán)范圍內(nèi)的各類檢測項(xiàng)目和參數(shù)，能獨(dú)立完成下達(dá)的能力驗(yàn)證項(xiàng)目。不能請其他機(jī)構(gòu)該方面的專家或者是實(shí)驗(yàn)室該工作崗位以外的人員承擔(dān)此項(xiàng)工作，即使能力驗(yàn)證最終的結(jié)果為滿意，對檢測式驗(yàn)的外部質(zhì)量控制沒有任何意義，更不能體現(xiàn)出實(shí)驗(yàn)室真實(shí)的檢測能力。

2.3.2 環(huán)境的控制

報(bào)名參加能力驗(yàn)證計(jì)劃后，要隨時(shí)關(guān)注能力驗(yàn)證組織者寄發(fā)測試樣品的動(dòng)態(tài)，提前對微生物實(shí)驗(yàn)室、生物安全柜進(jìn)行空氣潔凈度監(jiān)測，主要是沉降菌、浮游菌、懸浮粒子等參數(shù)，確保微生物實(shí)驗(yàn)室符合萬級要求，生物安全柜符合百級要求，方可開展檢測工作。無菌室的推薦溫度為20℃，相對濕度為40%～60%[8]。

2.3.3 檢測方法的控制

微生物能力驗(yàn)證一般要求各實(shí)驗(yàn)室優(yōu)先選擇常用的檢測方法。通常檢驗(yàn)人員對相關(guān)的檢測方法都能熟練操作，但是有一個(gè)常被忽視的點(diǎn)就是能力驗(yàn)證參試指導(dǎo)書，其對樣品的處理有詳細(xì)的規(guī)定，是檢測方法至關(guān)重要的一部分。接到能力驗(yàn)證樣品的第一時(shí)間，一定要認(rèn)真閱讀參試指導(dǎo)書，按照相關(guān)要求處理樣品，同時(shí)充分理解標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢測方法，才能確保后續(xù)試驗(yàn)順利進(jìn)行。

2.3.4 儀器設(shè)備及試劑的控制

（1）儀器設(shè)備。試驗(yàn)涉及的儀器設(shè)備均應(yīng)有效溯源（檢定或者校準(zhǔn)），同時(shí)相關(guān)的檢驗(yàn)人員對所用設(shè)備進(jìn)行計(jì)量確認(rèn)、確保儀器的各項(xiàng)參數(shù)滿足試驗(yàn)的要求。

（2）耗材及試劑。所用的耗材及試劑均應(yīng)按要求進(jìn)行滅菌處理（同時(shí)監(jiān)測滅菌效果），確保無菌狀態(tài)。最重要是培養(yǎng)基的制備，平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA培養(yǎng)基）一般要求的pH值在7.0±0.2，一定要對pH值進(jìn)行監(jiān)測，配置時(shí)先煮沸溶解，調(diào)pH值到指定的范圍內(nèi)，分裝試管或錐形瓶，于121℃下高壓滅菌15 min后備用。

2.3.5 試驗(yàn)操作環(huán)節(jié)的控制

無菌操作：嚴(yán)格按照無菌操作要求進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)開始前，應(yīng)對微生物實(shí)驗(yàn)室、生物安全柜紫外滅菌30 min換氣后，試驗(yàn)人員穿戴好衣、帽、口罩、手套、鞋套，方可進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室。能力驗(yàn)證樣品中含有活的微生物（可能含有致病菌），整個(gè)試驗(yàn)操作應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行。試驗(yàn)過程中，取用東西后，隨時(shí)用75%乙醇噴灑雙手，以免污染樣品。

詳細(xì)的檢測步驟在1.4中已提及注意事項(xiàng)：①樣品處理中若遇到難以溶解的情況，應(yīng)提前將稀釋液保溫到與培養(yǎng)基接近的溫度（一般為46±1℃），有利于凍干粉樣品更好溶解。②樣品轉(zhuǎn)移過程應(yīng)盡可能完全，60 mL的稀釋液可分多次清洗西林瓶內(nèi)壁及瓶蓋。③能力驗(yàn)證的樣品無法預(yù)估樣品污染的狀況，故不能依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)只選2～3個(gè)適宜的稀釋梯度，應(yīng)多制備幾個(gè)梯度，不要少于6個(gè)，每個(gè)稀釋度均做2個(gè)平皿。一是避免菌落數(shù)過多，稀釋越小難以計(jì)數(shù)，二是多個(gè)梯度的菌落生長狀況有利于發(fā)現(xiàn)規(guī)律（稀釋度越大，菌落數(shù)越少，反之亦然），選擇更適宜的梯度平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。④每個(gè)稀釋梯度，均應(yīng)準(zhǔn)確移取樣液和稀釋液，此為試驗(yàn)操作的關(guān)鍵一步。⑤實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)情況，選擇0.85%生理鹽水或者磷酸鹽緩沖液（PBS）作為稀釋液，兩者都是為了給微生物細(xì)胞提供一個(gè)相對穩(wěn)定的滲透壓，防止細(xì)胞因滲透壓改變而破裂或脫水死亡。在選擇稀釋液時(shí)還有一個(gè)原則，就是盡量與樣品處理的60 mL溶液保持一致。⑥試驗(yàn)中為防止稀釋液體積因高壓滅菌蒸發(fā)減小，應(yīng)先滅菌，再進(jìn)行分裝。⑦從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程應(yīng)控制在15 min內(nèi)[9]（在理想的溫濕度和營養(yǎng)條件下，細(xì)菌20 min進(jìn)行一次增殖）。

2.3.6 結(jié)果觀察與試驗(yàn)數(shù)據(jù)的控制

（1）生長過快或過慢。菌落經(jīng)過36℃培養(yǎng)后，一般在46～50 h進(jìn)行觀察，但是在實(shí)際操作過程中，培養(yǎng)24 h以后，菌落已能明顯計(jì)數(shù)，針對這種情況，應(yīng)隔一段時(shí)間觀察菌落的生長情況，并做好記錄，防止過早計(jì)數(shù)，漏掉生長緩慢的菌落；也要防止過晚計(jì)數(shù)，以免菌落過度生長，相互覆蓋，影響計(jì)數(shù)結(jié)果。另一方面，也存在菌落緩慢生長的情況，最長的培養(yǎng)時(shí)間不應(yīng)超過50 h，防止培養(yǎng)基缺水裂開造成計(jì)數(shù)不準(zhǔn)。無論是菌落生長過多或是個(gè)體太小，在肉眼觀察的同時(shí)，借用放大鏡來輔助計(jì)數(shù)。

（2）蔓延生長。傾倒培養(yǎng)基時(shí)再覆蓋4 mL，能有效防止菌落蔓延。但有時(shí)覆蓋后仍會(huì)出現(xiàn)蔓延的情況，這個(gè)時(shí)候還是要采用上面的方法，在菌落已能明顯計(jì)數(shù)的時(shí)候，多觀察，多記錄。對不同時(shí)間段的菌落數(shù)進(jìn)行記錄，選取相對穩(wěn)定的計(jì)數(shù)結(jié)果，避免后期菌落蔓延生長造成計(jì)數(shù)不準(zhǔn)。

對于較大片狀和鏈狀的菌落，GB 4789.2已有詳細(xì)的計(jì)數(shù)處理。每個(gè)稀釋梯度的平皿只有計(jì)數(shù)準(zhǔn)確了，才能選擇最適的計(jì)算方法，根據(jù)不同的情況選擇GB 4789.2—2016條款7.1中的6種方法進(jìn)行計(jì)算，并報(bào)送結(jié)果。

3 結(jié)論

通過比較連續(xù)2年能力驗(yàn)證的結(jié)果，分析不滿意、可疑結(jié)果的原因，并采取有效措施，通過再次的能力驗(yàn)證并獲得滿意結(jié)果。文中各環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制點(diǎn)和注意事項(xiàng)均為多次試驗(yàn)中積累，對于檢測機(jī)構(gòu)開展同類試驗(yàn)具有一定的指導(dǎo)意義。微生物檢測不同于其他的理化檢驗(yàn)，日常檢驗(yàn)中的樣品中很少有陽性菌，對于試驗(yàn)操作人員來說，很多微生物檢驗(yàn)，尤其是涉及致病菌的檢驗(yàn)，往往進(jìn)行到分離培養(yǎng)環(huán)節(jié)就結(jié)束，很少進(jìn)行到鑒定環(huán)節(jié)。所以很多檢測機(jī)構(gòu)都存在微生物檢驗(yàn)人員雖然熟悉完整流程，卻很少能操作下來的問題。而解決這一問題，最有效的手段就是參加能力驗(yàn)證。能力驗(yàn)證大部分都是陽性樣品，能夠鍛煉和提升檢驗(yàn)人員的技術(shù)水平；同時(shí)，能力驗(yàn)證的結(jié)果可以作為體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室檢測能力的有效證明，既可以為監(jiān)管機(jī)構(gòu)評價(jià)和認(rèn)可有能力的實(shí)驗(yàn)室提供依據(jù)，又可以為客戶和其他利益共同體選擇合適的檢測機(jī)構(gòu)提供參考。鼓勵(lì)各檢測機(jī)構(gòu)積極參加能力驗(yàn)證，通過能力驗(yàn)證，可及時(shí)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室在各個(gè)環(huán)節(jié)存在的問題，是確保實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量體系持續(xù)有效的重要手段[10]。