新型聚合物納米造影劑的合成及體內磁共振成像研究

孫天賜, 楊 懷, 閆 旭, 方蔚偉, 張培松, 何 濤

(1.合肥工業大學 化學與化工學院,安徽 合肥 230009; 2.武警安徽省總隊醫院 普外三科,安徽 合肥 230061)

磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)無輻射、安全性高、軟組織分辨能力較強,在臨床影像醫學腫瘤檢測上應用廣泛[1]。MRI通常需要使用造影劑(contrast agent)進行高分辨的影像學診斷[2]。臨床上一般用低分子量的釓(Gd)類鰲合物造影劑來提升磁共振信號,如Magnevist、Omniscan等,但這些造影劑具有體內循環時間短、弛豫率低、用藥量大等缺點[3-5]。近年來,為了克服現有造影劑的缺點,納米技術被廣泛應用于MRI造影劑的研究中,相關研究表明尺寸小于20 nm的納米造影劑具有較低的細胞攝取水平以及更長的體內滯留時間[6-7]。兩親性聚合物納米顆粒是良好的藥物傳遞載體,將釓融入聚合物納米中制備的納米造影劑有良好的弛豫性能[8]。兩親性聚合物納米顆粒一般基于樹枝狀聚合物、星狀聚合物等結構,或者是由兩親性共聚物自組裝得到[9]。但是樹枝狀聚合物、星狀聚合物納米合成步驟繁瑣,提純困難[10];由兩親性共聚物自組裝得到的聚合物納米結構不穩定[11]。因此,制備合成過程簡單、無需自組裝的兩親性聚合物納米載體具有重要的科研和利用價值。

本文直接合成不需要自組裝的兩親性支化共聚物納米顆粒,并用于合成納米造影劑。采用可逆加成-斷裂鏈轉移聚合(reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization,RAFT)方法,以疏水性單體甲基丙烯酸正丁酯(n-BMA)與交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)共聚物鏈段作為疏水性內核,親水性單體寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯(OEGMA)與含1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三乙酸三叔丁酯(DO3A)結構的單體共聚物鏈段作為親水性支鏈形成兩親性支化聚合物納米顆粒(P(DO3A)),與氯化釓(Ⅲ)六水合物(GdCl3·6H2O)進行螯合反應后合成了一種新型的MRI納米造影劑P(DO3A-Gd3+);研究了P(DO3A-Gd3+)生物安全性以及MRI造影性能,結果表明:P(DO3A-Gd3+)具有良好的生物安全性以及顯著的MRI造影增強效果;P(DO3A-Gd3+)納米顆粒由單個支化聚合物納米顆粒P(DO3A)螯合Gd3+構成,無需自組裝,合成方法簡單,可大量制備,有臨床轉化的潛力。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

4-氰基-4-(苯基碳硫硫基硫代)戊酸N-琥珀酰亞胺酯(CTA-NHS)購于Aldrich;寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯(OEGMA,Mw為300)、甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)、溴乙酸(BA)、甲基丙烯酸正丁酯(n-BMA)、1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三乙酸叔丁醇乙酯(TBTT)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，均購于Aladdin;三氟乙酸(TFA)、氯化釓(Ⅲ)六水合物(GdCl3·6H2O)、二氯甲烷(DCM)、乙腈、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，均購于國藥集團。

采用安捷倫VNMR S600型核磁共振儀進行核磁共振氫譜(1H nuclear magnetic resonance,1H NMR)測試;采用馬爾文MS-2000型激光粒度分析儀進行動態光散射(dynamic light scaltering,DLS)測試;采用日本JEM-2100F型場發射透射電子顯微鏡(field emission transmission electron microscope,FETEM)分析樣品形貌結構。

1.2 實驗過程

1.2.1 聚合物納米造影劑的合成

聚合物納米造影劑的合成過程如圖1所示。

圖1 聚合物納米造影劑的合成過程

將HEMA(1 mmol/L)與BA(1.5 mmol/L)溶解在20 mL DCM中,反應24 h,通過純化得到產物HEMA-BA。將HEMA-BA(1 mmol/L)與TBTT(1 mmol/L)溶解在20 mL 乙腈中,反應24 h,通過純化得到產物HEMA-TBTT。

鏈轉移劑CTA-NHS(0.1 mmol/L),單體OEGMA(1 mmol/L)、HEMA-TBTT(0.5 mmol/L),引發劑AIBN(0.01 mmol/L)在反應管中溶解于3 mL DMF,隨后在無氧條件下70 ℃反應12 h。反應結束后,減壓除去溶劑,粗產物在甲醇中沉降3次,干燥得到共聚物P1(POEGMA-HEMA-TBTT)。

將P1(0.8 g,1 mmol/L),單體n-BMA(10 mmol/L),引發劑AIBN(0.01 mmol/L),交聯劑EDGMA(0.15 mmol/L)溶解于4 mL DMF中,液氮冷凍脫氣,70 ℃下反應10 h。反應結束后,減壓除去溶劑,粗產物在甲醇中沉降3次,干燥得到支化共聚物納米顆粒P2(PEGDMA-n-BMA-OEGMA-HEMA-TBTT)。

上述支化聚合物P2(2.00 g)與TFA(10 mL)溶解在20 mL DCM中,0 ℃下反應4 h,切斷HEMA-TBTT鏈段中的叔丁基。反應結束后,粗產物去除溶劑,用5 mL THF復溶,隨后在冰的正己烷中沉降,真空干燥后得到產物P3(PEGDMA-n-BMA-OEGMA-HEMA-DO3A)，簡稱P(DO3A)。

將P3(1 g)溶解在15 mL 異丙醇中,將GdCl3·6H2O(1.86 g,5 mmol)溶解在50 mL 乙酸銨中后與上述溶液混合,55 ℃下反應24 h。反應結束后,混合溶液在水中透析48 h,干燥后用THF復溶,隨后在冰的正己烷中沉降,真空干燥后得到納米造影劑P4(P(DO3A-Gd3+))。

1.2.2 細胞安全性測試

細胞安全性的測試采用標準的3-(4,5二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法[12]。將小鼠乳腺癌細胞(4T1)以5×104個/孔接種于含有細胞培養基的96孔板中,然后加入不同濃度Gd3+的P(DO3A-Gd3+),在37 ℃、5% CO2環境下共培養24 h。采用PBS洗滌細胞3次,再在每個孔板中加入50 μL MTT(1 mg/mL),于37 ℃繼續培養4 h。接著去除上清液,加入100 μL二甲亞砜后搖勻,用分光光度酶標儀(Elx800,BioTek,USA)測定570 nm處的吸光度,相對細胞活性計算公式為:

相對細胞活性=(Atreated/Acontrol)×100%,

其中:Atreated為P(DO3A-Gd3+)共培養后的吸光度;Acontrol為培養液的吸光度值。

1.2.3 生物安全性測試

將10只新西蘭小鼠(雄性,24 g)分為2組:一組通過尾靜脈注射P(DO3A-Gd3+)作為實驗組;另一組不做任何處理作為對照組。將2組小鼠在相同的環境下培育14 d,通過觀察2組小鼠的生理狀況來評估P(DO3A-Gd3+)的生物安全性。

1.2.4 體外弛豫率的測定

將P(DO3A-Gd3+)溶液以及Magnevist注射液各稀釋至含Gd3+濃度為0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.800 mmol/L的水溶液,移至離心管中并置于臨床Siemens Magnetom Trio 3.0T MR成像儀中掃描,測得不同濃度的縱向弛豫時間T1,儀器參數為:回波時間TE為7 ms;重復時間TR為31、300、700、1 400、2 500、3 500、5 500、7 500 ms。弛豫率r1由縱向弛豫時間T1的倒數對Gd3+濃度進行線性擬合得到。

1.2.5 體內MRI測試

用10%的水合氯醛麻醉25 g的小鼠后,尾靜脈注射P(DO3A-Gd3+)水溶液(Gd約0.05 mmol/kg),置于臨床Siemens Magnetom Trio 3.0T MR成像儀中掃描。分別收集0、60、120 min時的T1加權圖像。

2 結果與討論

2.1 P(DO3A)的合成

聚合物納米P(DO3A)的1HNMR譜圖如圖2所示。

從圖2可以看出,P2鏈段中各單體的主要氫質子的化學位移有δ=1.38處表示HEMA-TBTT鏈段上叔丁基的質子峰;δ=0.93處表示聚合物主鏈上甲基的質子峰;δ=1.80處表示聚合物主鏈上亞甲基的質子峰;δ=3.64、3.53處表示POEGMA鏈段上亞甲基的質子峰;δ=3.64處歸屬于POEGMA鏈段上末端甲基的質子峰;δ=3.92,1.59,1.31處表示n-BMA鏈段上亞甲基的質子峰;δ=0.85處為n-BMA鏈段末端甲基的質子峰,表明聚合物納米P(DO3A)的成功合成。

圖2 聚合物納米P(DO3A)的1H NMR譜圖

2.2 P(DO3A-Gd3+)的形貌和尺寸分析

對鰲合釓后的P(DO3A-Gd3+)納米顆粒水溶液進行形貌和尺寸分析,如圖3所示。

圖3 P(DO3A-Gd3+)納米顆粒水溶液形貌和尺寸

從圖3a可以看出,納米顆粒的尺寸在100 nm左右,呈單分散狀態且形貌比較均一。從圖3b可以看出,納米顆粒的尺寸在110 nm左右,且分布均勻。一個P(DO3A-Gd3+)納米顆粒由單個超支化聚合物納米顆粒P(DO3A)螯合若干Gd3+構成,無需自組裝,因此呈單分散狀態且形貌比較均一。Gd3+能穩定鰲合在納米顆粒內部,不易泄露,因此相對于小分子造影劑,P(DO3A-Gd3+)具有更好的穩定性。均一的納米尺寸能夠提高P(DO3A-Gd3+)的細胞攝取性,延長其在體內的循環時間。

2.3 P(DO3A-Gd3+)的安全性分析

P(DO3A-Gd3+)的細胞安全性用MTT法進行衡量,如圖4所示。

圖4 P(DO3A-Gd3+)的細胞安全性MTT法衡量

從圖4a可以看出,當P(DO3A-Gd3+)的質量濃度大于200 μg/mL時,4T1細胞相對細胞活性仍然高于95%,表明P(DO3A-Gd3+)具有很高的細胞安全性。

從圖4b可以看出,在相同環境下培養14 d內,注射P(DO3A-Gd3+)的小鼠與未處理的正常小鼠體質量沒出現明顯差別。在實驗過程中,2組小鼠生理狀況良好,全部存活,表明P(DO3A-Gd3+)具有良好的生物安全性。

2.4 P(DO3A-Gd3+)的體外弛豫率

P(DO3A-Gd3+)的體外T1加權圖像和P(DO3A-Gd3+)、Magnevist的弛豫率r1擬合圖如圖5所示。

圖5 P(DO3A-Gd3+)的體外T1加權圖像和弛豫率r1擬合圖

體外MRI成像結果表明P(DO3A-Gd3+)有顯著的MRI增強效果;P(DO3A-Gd3+)的弛豫率為5.3(mmol/L)-1·s-1,比臨床造影劑Magnevist(約2.94(mmol/L)-1·s-1)的高,表明P(DO3A-Gd3+)弛豫性能更強,從而能夠在一定程度上降低用藥量,有良好的臨床應用前景。P(DO3A-Gd3+)中親水的POEGMA和內部交聯納米結構能夠有效地提高造影劑的水交換速率,進而提高弛豫率[13-14]。

2.5 P(DO3A-Gd3+)的體內MRI成像

為進一步驗證P(DO3A-Gd3+)在體內的造影增強效果,采用尾靜脈注射法將P(DO3A-Gd3+)注射到已長出腫瘤的老鼠體內,在不同時間點對老鼠的腫瘤部位進行MRI掃描。不同時間點的T1加權圖像如圖6所示。從圖6可以看出,在注射P(DO3A-Gd3+)60 min后腫瘤部位明顯變亮,120 min后仍然具有明顯的造影效果,表明P(DO3A-Gd3+)具有很好的MRI造影功能。

圖6 腫瘤鼠在注射P(DO3A-Gd3+)后體內T1加權圖像

3 結 論

本文通過可逆加成-斷裂鏈轉移聚合方法合成了一種不需要復雜自組裝的兩親性支化共聚物納米顆粒(PEGDMA-n-BMA-OEGMA-HEMA-DO3A),以該共聚物作為基體鰲合GdCl3·6H2O,制備了一種新型的聚合物MRI納米造影劑P(DO3A-Gd3+)并對其性能進行表征。其結構與尺寸測試結果表明,P(DO3A-Gd3+)納米結構穩定;細胞安全性以及生物安全性測試結果表明,P(DO3A-Gd3+)具有良好的生物安全性;體外弛豫率測試結果表明,P(DO3A-Gd3+)具有很好的MRI造影增強效果。P(DO3A-Gd3+)的合成方法簡單,可大量制備,相比于臨床造影劑有更好的弛豫性能以及穩定性,同時體內循環時間更長、用藥量更低,有向臨床轉化的潛力。