擴展青霉菌實時定量PCR內(nèi)參基因挖掘與應(yīng)用

張真真, 蔣禮玲, 李婉炘, 王謹(jǐn)凡, 賈舉慶, 黃勝雄

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601; 2.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院,青海 西寧 810016; 3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,山西 晉中 030801)

0 引 言

內(nèi)參基因可以定義為在特定條件下預(yù)期表達水平不受影響的基因,其在不同的實驗處理條件下或不同組織、器官中可穩(wěn)定地表達[1-2]。實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是最常用的檢測基因表達水平和驗證RNA-seq結(jié)果數(shù)據(jù)的技術(shù)方法[3]。結(jié)合目標(biāo)基因與內(nèi)參基因的實時定量PCR數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)化,可以得到精確且可以相互比較的目標(biāo)基因的表達值。標(biāo)準(zhǔn)化依賴于所選擇的內(nèi)參基因,不穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因?qū)@著影響目標(biāo)基因表達定量的準(zhǔn)確性和可靠性。

18S核糖體rRNA(18SrRNA)、肌動蛋白基因(ACT)、延伸因子基因(EF-1α)、微管蛋白基因(TUB)、聚泛素基因(UBQ)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)等[4-6]管家基因(HKGs)參與基本的細胞過程,被認(rèn)為具有穩(wěn)定的表達水平,經(jīng)常被廣泛作為內(nèi)參基因使用。越來越多的研究表明,部分管家基因在不同生長、發(fā)育階段或不同處理條件下的組織材料中的表達水平存在較大的波動[7-9]。

因此,對于特定的實驗材料,開發(fā)和鑒定特異的內(nèi)參基因很有必要。目前在生物學(xué)研究中,基于geNorm[10]、NormFinder[11]、BestKeeper[6]在內(nèi)的生物軟件對實時定量PCR數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析,已經(jīng)成功篩選得到適用于不同特異的實驗材料所需的內(nèi)參基因。微生物研究中,內(nèi)參基因的研究多集中于對傳統(tǒng)內(nèi)參基因穩(wěn)定性的評估,新的內(nèi)參基因的開發(fā)研究較少[12-13]。有研究者認(rèn)為可以根據(jù)基因的功能類別,發(fā)現(xiàn)新的內(nèi)參基因,選擇適合特定微生物物種的特定內(nèi)參基因[14]。文獻[15]基于基因功能注釋,利用實時定量PCR,通過geNorm、NormFinder、RefFinder 軟件評價,篩選出適用于柑橘黃龍病菌感染不同寄主及感染不同時期的新內(nèi)參基因ftsZ和gyrA。文獻[16]基于轉(zhuǎn)錄組測序,采用geNorm和NormFinder軟件篩選及定量驗證發(fā)現(xiàn)了優(yōu)于傳統(tǒng)內(nèi)參基因的glyS和degV基因更適合作為嗜熱鏈球菌的新內(nèi)參基因。

擴展青霉菌(Penicilliumexpansum)屬于青霉菌屬[17],侵染蘋果、獼猴桃、柑橘等水果果實,造成大規(guī)模的經(jīng)濟損失。目前,擴展青霉菌的研究主要集中在基因組學(xué)、毒力基因的挖掘、棒曲霉素代謝等方面。40SribosomalproteinS24(PEX2-023930)基因常常被作為實時定量PCR的內(nèi)參基因,但其在擴展青霉菌不同生長階段存在穩(wěn)定的基因表達水平尚未得到驗證。目前,擴展青霉菌缺乏系統(tǒng)的篩選和評估內(nèi)參基因的研究，隨著擴展青霉菌中分子生物學(xué)研究的深入開展,開發(fā)和驗證新的內(nèi)參基因具有重要的意義和應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 微生物材料

擴展青霉菌由以色列農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究組Samir Droby教授提供,由本課題組保存。

1.2 基于RNA-seq的候選內(nèi)參基因挖掘和注釋

用滅菌槍頭刮取PDA平板上培養(yǎng)7 d的擴展青霉菌的孢子,懸浮于含0.02% Tween-20的蒸餾水中,調(diào)制為108個/mL孢子液。取該孢子液2 mL加入到30 mL PDB液體培養(yǎng)基中,分別置于4、25 ℃條件下180 r/min振蕩培養(yǎng),在生長8、12 h時分別離心收集菌體,液氮中冷凍1 h以上,將菌體樣品送派森諾公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。

基于RNA-seq的基因表達值,候選內(nèi)參基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)如下:轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中基因表達值的平均值≥15 FPKM,且變異系數(shù)≤0.15。滿足以上條件的基因被篩選鑒定為候選內(nèi)參基因。利用Blast2GO軟件進行候選內(nèi)參基因在基因本體(gene ontology,GO)數(shù)據(jù)庫中的注釋。

1.3 候選內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR引物設(shè)計

從RNA-seq數(shù)據(jù)鑒定的候選內(nèi)參基因中隨機挑選14個基因(Knr4、Isy1、Spt5、Nucb、Hp1、Hp2、Whth、Hp3、Gph3、Pwi、Taf4、Hp4、Asy、GTPase)進行后續(xù)研究。利用美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)引物設(shè)計軟件Primer-Blast(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)進行實時定量PCR實驗的引物設(shè)計。所有設(shè)計的引物退火溫度為58～62 ℃。實時定量PCR擴增的條帶大小限制在80～200 bp之間。

1.4 總RNA提取和cDNA反轉(zhuǎn)錄合成

在4、25 ℃條件下180 r/min,PDB液體培養(yǎng)基中生長6、12、24、36 h的擴展青霉菌,離心棄上清,-80 ℃超低溫冰柜保存?zhèn)溆谩?/p>

利用RNA提取試劑TransZol UP(TransGen,China)進行擴展青霉菌總RNA的提取。cDNA反轉(zhuǎn)錄合成的20 μL反應(yīng)體系的主要成分如下:2 μg的總RNA,2 μL的5×gDNA Buffer,2 μL的10×King RT Buffer,1 μL的FastKing RT Enzyme Mix(TIANGEN,China),2 μL 的FQ-RT Primer Mix,RNase-free ddH2O補足到20 μL。反應(yīng)條件如下:42 ℃,15 min;95 ℃,3 min。

1.5 實時定量PCR擴增體系與反應(yīng)條件

利用LightCycler 96 PCR System(Roche, Swiss)進行基因的實時定量PCR。20 μL的反應(yīng)體系如下:0.5 μL的cDNA,10 μL的2×SuperReal Color PreMix(TIANGEN,China),0.5 μL的Dilution Buffer,引物各0.6 μL,7.8 μL的ddH2O。

反應(yīng)條件如下:95 ℃,15 min;95 ℃,10 s,60 ℃,30 s,重復(fù)40個循環(huán);然后從60 ℃升溫到95 ℃進行熔解曲線分析。每個樣品重復(fù)3次實時定量PCR實驗。

1.6 候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析

本文利用LightCycler 96 PCR System自帶軟件導(dǎo)出實時定量PCR的結(jié)果數(shù)據(jù)(Cq值)。將Cq值作為輸入數(shù)據(jù),分別在geNorm[11]、NormFinder[12]軟件中進行候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選內(nèi)參基因的挖掘和注釋分析

RNA-seq數(shù)據(jù)包括4、25 ℃條件下,分別在PDB液體培養(yǎng)基生長8、12 h的擴展青霉菌孢子的基因表達值。首先,設(shè)置基因在4個樣品中的基因表達值的平均值≥15 FPKM,過濾掉低表達不可信的基因;其次,設(shè)置4個樣品之間基因表達值的變異系數(shù)≤0.15,篩選穩(wěn)定表達的基因,過濾掉不同樣品之間基因表達水平差異大的基因;最后,滿足以上條件的共有694個基因被鑒定為候選內(nèi)參基因,約占全基因組編碼基因的6%(694/11 060)。

利用Blast2GO軟件,在GO數(shù)據(jù)庫進行了694個候選內(nèi)參基因的GO注釋,提取了“Molecular Function”模塊中的功能注釋。“Molecular Function”模塊中基因富集最多的9個GO條目見表1所列。從表1可以看出，最多有15個基因富集在2級GO條目“Binding”;在3級GO“Heterocyclic compound binding”和“Organic cyclic compound binding”條目中,均存在于9個基因定位中。從富集結(jié)果看,這些穩(wěn)定表達的基因主要涉及催化和綁定結(jié)合兩大功能。

表1 “Molecular Function”模塊中的9個富集GO條目

2.2 候選內(nèi)參基因的挑選和片段克隆

從694個候選內(nèi)參基因中隨機挑選14個基因,包括Knr4、Isy1、Spt5、Nucb、Hp1、Hp2、Whth、Hp3、Gph3、Pwi、Taf4、Hp4、Asy、GTPase,進行后續(xù)的實時定量PCR實驗。14個基因在RNA-seq數(shù)據(jù)中的表達值見表2所列。在4個RNA-seq樣品之間,Knr4、Isy1、Spt5、Nucb、Hp1、Hp2、Whth、Hp3、Gph3、Pwi、Taf4、Hp4、Asy、GTPase基因的表達水平均值為(28.49±0.35)～(1 711.72±197.61)FPKM;表達水平的變異系數(shù)介于0.01～0.12。最穩(wěn)定表達的基因是Hp1(PEX2-018900),變異系數(shù)為0.01。

表2 RNA-seq數(shù)據(jù)中14個候選內(nèi)參基因的表達水平

基于基因序列進行了上述14個基因的實時定量PCR引物設(shè)計,引物退火溫度為58～62 ℃,擴增長度為80～200 bp,具體引物序列見表3所列。首先進行了基因片段的常規(guī)PCR擴增實驗,擴增結(jié)果如圖1所示，圖1中,L1～L14泳道分別表示Knr4、Isy1、Spt5、Nucb、Hp1、Hp2、Whth、Hp3、Gph3、Pwi、Taf4、Hp4、Asy、GTPase基因的擴增結(jié)果。

表3 候選內(nèi)參基因的定量PCR引物

由圖1可知,本文得到了特異的DNA擴增條帶,大小和設(shè)計完全一致。表明設(shè)計引物適用于目的基因特異片段的擴增,可以用于后續(xù)的實時定量PCR實驗。

圖1 候選內(nèi)參基因的常規(guī)PCR擴增結(jié)果

2.3 候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析

以在PDB液體培養(yǎng)基中4、25 ℃條件下生長6、12、24、36 h后的擴展青霉菌為實驗材料,對Knr4、Isy1、Spt5、Nucb、Hp1、Hp2、Whth、Hp3、Gph3、Pwi、Taf4、Hp4、Asy、GTPase基因進行實時定量PCR實驗。

14個候選基因的熔解曲線均只存在一個重疊峰,沒有雜峰產(chǎn)生，其中Isy1的熔解曲線峰圖如圖2所示。結(jié)果證明實時定量PCR擴增條帶單一,實驗成功進行。

圖2 Isy1基因的熔解曲線

將Knr4、Isy1、Spt5、Nucb、Hp1、Hp2、Whth、Hp3、Gph3、Pwi、Taf4、Hp4、Asy、GTPase基因在25 ℃條件下不同生長階段的擴展青霉菌材料的實時定量PCR結(jié)果Cq值作為輸入數(shù)據(jù),在geNorm和NormFinder軟件中分別進行穩(wěn)定性分析,結(jié)果如圖3所示,由圖3可知,數(shù)值越低穩(wěn)定性越高,geNorm分析結(jié)果默認(rèn)高于1.5閾值的基因不適合作為內(nèi)參基因。

圖3 14個候選內(nèi)參基因在NormFinder和geNorm中的穩(wěn)定性分析結(jié)果

去掉高于1.5閾值的后7個基因,將其余的Knr4、Isy1、Spt5、Nucb、Hp1、Hp3、Gph3基因在4 ℃條件下不同生長階段的擴展青霉菌材料的實時定量PCR數(shù)據(jù)進行分析。在geNorm和NormFinder軟件中穩(wěn)定性分析排序結(jié)果如圖4所示。

由圖4a可知,除去Knr4的分析值較高,其余4個基因(Isy1、Spt5、Nucb、Hp1)的分析值都低于0.02,具有較高的穩(wěn)定性,適合作為內(nèi)參基因。由圖4b可知,Knr4、Isy1、Spt5、Nucb、Hp1的分析結(jié)果低于geNorm的1.5的閾值條件。綜合分析表明,Isy1、Spt5、Nucb、Hp1可以作為合適的內(nèi)參基因,用于在4、25 ℃條件下,生長36 h以內(nèi)的擴展青霉菌的基因定量研究。

圖4 7個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析結(jié)果

2.4 內(nèi)參基因的應(yīng)用

將Isy1和Spt5基因作為內(nèi)參基因,分別在PDB液體培養(yǎng)基中,4、25 ℃條件下生長6、12、24 h的擴展青霉菌為實驗材料,進行了glycoside hydrolase編碼基因Gh30(PEX2-044530)的實時定量PCR實驗。Gh30基因的定量引物對如下。

上游引物:5’-CAGTCACCTCCTTCAACACGC-3’;

下游引物:5’-CGCATTGTTCCCATTATCGTC-3’。

以Isy1和Spt5作為內(nèi)參基因進行Gh30的表達水平定量結(jié)果如圖5所示。圖5中,**表示P<0.01顯著性差異。

圖5 Isy1和Spt5基因定量的Gh30基因表達水平

由圖5可知,在相同系列的試驗材料中,Gh30基因顯示出一致的表達趨勢。表明上述2個基因可以作為內(nèi)參基因,用于不同溫度條件下早期發(fā)育階段(24 h以內(nèi))的擴展青霉菌基因表達的定量研究。

3 討 論

大量研究表明,18S核糖體、內(nèi)修基因ACT、延伸因子EF-1α基因等傳統(tǒng)內(nèi)參基因不存在絕對的恒定表達,在不同生長發(fā)育階段或不同實驗條件處理下的實驗材料中,基因表達存在較大的波動[7-9]。

本研究利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和實時定量PCR,鑒定得到Isy1、Spt5、Nucb、Hp1基因適合作為不同溫度條件下的內(nèi)參基因，且對Isy1和Spt5基因進行了驗證。

目前,得益于測序技術(shù)的進步和測序成本的大幅降低,包括NCBI在內(nèi)的公共數(shù)據(jù)庫中有大量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),這對于內(nèi)參基因的開發(fā)提供了大量的基因表達數(shù)據(jù)以供參考。此外,多種算法聯(lián)用分析內(nèi)參基因的穩(wěn)定性逐漸成為主流,本研究采用geNorm 和 NormFinder軟件進行基因表達穩(wěn)定性分析。目前,基因穩(wěn)定性分析有多種分析軟件可供選擇,包括geNorm[10]、NormFinder[11]、BestKeeper[6]。結(jié)合2種以上的分析軟件,基于不同算法綜合進行基因表達穩(wěn)定性分析,可以取得良好的分析結(jié)果。